Method Article

Мониторинг Бегемот, сигнальный путь активности с помощью биосенсора супрессор (лат) на основе Люцифераза большой опухоли

DOI:

10.3791/58416

⸱

September 13th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем на основе Люцифераза биосенсора для количественного определения активности протеинкиназы большие опухолевые супрессоры (лат)-Центральный киназы в бегемота, сигнальный путь. Этот биодатчик имеет разнообразные применения в базовых и трансляционного исследования, направленные на расследование Бегемот путь регуляторы в пробирке и в естественных условиях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бегемот, сигнальный путь является регулятором сохраняется размер органа и важную роль в биологии развития и рака. Из-за технических проблем по-прежнему трудно оценить деятельность этой сигнальный путь и интерпретировать его в биологическом контексте. В существующей литературе по большие опухолевые супрессоры (лат) опирается на методы, которые носят качественный характер и не может легко быть увеличен для скрининга. Недавно мы разработали на основе биолюминесценции биосенсора для мониторинга активности протеинкиназы ЛАТОВ а основного компонента Каскад киназы Бегемот. Здесь мы описываем процедуры как это биосенсор ЛАТОВ (ЛАТОВ-BS) может использоваться для характеристики Бегемот путь регуляторы. Во-первых мы предоставляем подробный протокол для расследования эффект гиперэкспрессия белка кандидата (например, VEGFR2) на активность ЛАТОВ, используя ЛАТОВ-BS. Затем мы покажем, как ЛАТОВ-BS может использоваться для небольших киназы ингибитора экрана. Этот протокол реально может быть увеличен для выполнения больших экранов, которые несомненно будут определены новые регуляторы Бегемот пути.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бегемот, сигнальные пути была впервые выявлена у дрозофилы как Роман регулятор роста клеток и животных размер1,2. С момента ее первоначального открытия, монтаж доказательства убедительно показал, что бегемот путь играет важнейшую роль в развитии (например, раннего эмбрионального развития, орган управления размер и трехмерные [3-D] Морфология), опухолей () например, развитие опухоли, метастазы, ангиогенез, иммунных уклонение, геномной нестабильности, реакции на стресс и лекарственной устойчивости) и ткани гомеостаза (например, обновление стволовых клеток и дифференциации и ре....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. расследование разоблачало регулятора Бегемот сигнализации с помощью ЛАТОВ BS

  1. Обшивка и transfection клеток
    1. Подготовка клеточной культуры
      1. Тепло 1 x PBS, DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и трипсин 0.25%-ЭДТА до 37 ° C в водяной бане около 30 мин.
      2. Тщательно очистите биобезопасности кабинет с 70% этиловом спирте.
      3. Место культуры ткани блюда, пипетки Пастера, серологические пипетки и наконечники в культуре ткани капюшон при необходимости.
      4. Взять 1 x PBS, средства массовой информации и трипсин ЭДТА из водяной бани, чистить их с 70% этиловом спирте и поместите их в капот....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ЛАТ-BS был cotransfected с различными генами, чтобы оценить их влияние на активность ЛАТОВ (рис. 3). В этом эксперименте Renilla был использован как внутреннего контроля. Переходных выражение яп 5SA, учредительный активной формы YAP, причины повышения уровня яп транскрипционный анализ целей и последующее увеличение активности протеинкиназы ЛАТОВ через установленные обратной связи путь25. MST, вверх по течению активатор ЛАТОВ в.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как Бегемот путь играет важную роль в различных биологических процессах, и регуляции Бегемот путь приводит к рака6, как Бегемот путь регулируется в ответ на различные стимулы полностью не поняты. Кроме того был не количественные, так и в реальном времени системы для оценки деятельности основных компонентов Бегемот. Недавно мы разработали и проверены Роман биосенсора для измерения активности протеинкиназы ЛАТОВ в бегемота путь24. Этот биодатчик может использоватьс.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана от грантов от Канадского института медицинских исследований (КНИИЗ #119325, 148629) и Канадский Фонд рака молочной железы (CBCF) для XY. TA поддерживается Ванье Канада Магистратура стипендии и стипендии выпускников Международного Онтарио. HJJVR поддерживается королевы Елизаветы II выпускников стипендии в области науки и техники.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильный>Трипсин-ЭДТА  Life Technologies25200560,25%
<сильная>фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF1051
DMEMSigmaD6429-500mlDMEM с высоким содержанием глюкозы 
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140122
PolyJet In Vitro реагент для трансфекции ДНК  SignagenSL100688,5
5x Пассивный буфер для лизисаPromegaE194A30 мл
Dual-Glo® Люцифераза Пробирная системаPromegaE2940100 мл
набор20/20 люминометрTurner Biosystems998-2036Однотрубочный считыватель люминометра
GloMax® Навигатор с двойными форсункамиPromegaGM201096-луночный считыватель пластин люминометра

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hippo Signaling PathwayLATS BiosensorLuciferase AssayKinase Activity MonitoringPlasmid TransfectionHEK293 CellsSmall Molecule ScreeningWestern BlotQuantitative PCRPlate Reader Luminometer

Related Articles