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方法文章

使用 FishSim 动画工具链研究鱼类行为：以帆鳍花鳉中配偶选择模仿为例

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DOI：

10.3791/58435

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2018年11月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Group of Ecology and Behavioral Biology, Institute of Biology, University of Siegen, 2University of Calgary, 3Institute of Real-Time Learning Systems, University of Siegen

本文内容

摘要

利用新型的 FishSim 动画工具链，我们提出了一种在帆鳍花鳉求偶选择模仿行为研究中非侵入性地视觉操控公共信息的实验方案。FishSim 动画工具链为设计、制作和呈现用于活体测试鱼类行为实验的计算机动画鱼类刺激提供了易于使用的框架。

摘要

在过去十年中，由于计算机动画能够以非侵入性方式操控视觉刺激的外观和行为，相比操控活体动物具有优势，因此在动物行为研究中的应用日益增多。本文介绍了FishSim动画工具链，这是一种软件框架，旨在为研究人员提供一种简便易用的方法，将三维计算机动画应用于鱼类行为实验中。该工具链提供了五种不同鱼类物种的虚拟三维刺激模板。这些刺激可根据活体鱼的照片进行外观和尺寸的个性化定制。通过使用视频游戏控制器在虚拟环境中记录游泳路径，可实现多个刺激的动画化。为了提高模拟行为的标准化程度，预先录制的游泳路径可应用于不同的刺激进行回放。多个动画随后可被组织成播放列表，并在活鱼实验过程中于显示器上呈现。

在一项关于帆鳍花鳉（Poecilia latipinna）的案例研究中，我们提供了一种使用FishSim进行配偶选择模仿实验的操作方案。我们利用该方法创建并动画化了虚拟雄鱼和虚拟示范雌鱼，随后在二选一选择实验中将这些动画呈现给活体目标雌鱼。我们的结果表明，计算机动画可用于在配偶选择模仿实验中模拟虚拟鱼类，以研究雌鱼妊娠斑作为示范雌鱼质量信号在配偶选择模仿中的作用。

该方法的应用不仅限于配偶选择复制实验，还可用于多种实验设计。然而，其可用性取决于研究物种的视觉能力，且首先需要验证。总体而言，计算机动画为实验提供了高度的控制性和标准化，并具有“减少”和“替代”活体刺激动物以及“优化”实验流程的潜力。

引言

近年来，利用现代技术创建人工刺激（如计算机动画和虚拟现实）在研究中日益流行1。与使用活体刺激动物的传统实验方法相比，这些方法具有多项优势1,2。计算机动画能够以非侵入性方式操控实验中所用虚拟刺激动物的外观（如体型、颜色）和行为。例如，在针对绿剑尾鱼（Xiphophorus helleri）的研究中，早期研究需通过手术移除雄性个体的剑尾以检验雌性的配偶偏好3，而后续研究通过使用计算机动画，已不再需要此类手术操作4。此外，计算机动画还可构建自然界中极为罕见的表型5，甚至可将虚拟动物的形态特征调整至超出该物种自然变异范围的程度4。特别是对行为进行系统性操控的可能性，是计算机动画的一大显著优势，因为这一点在使用活体动物时几乎无法实现6,7。

目前已有多种技术可用于制作计算机动画。简单的二维（2D）动画通常基于刺激物仅在两个维度上移动的图像，可使用常见的软件如 MS PowerPoint8 或 Adobe After Effects9 制作。三维（3D）动画则需要更复杂的3D图形建模软件，能够实现刺激物在三维空间中的运动，从而增强物理运动的真实性和复杂性6,7,10,11,12。甚至已有研究采用虚拟现实设计，模拟供活体动物导航的三维环境13,14。在最近的一篇综述中，Chouinard-Thuly et al. 2 逐项讨论了这些技术，并指出了它们在研究中应用的优缺点，这些优缺点显著依赖于研究范围和测试动物的视觉能力（见“讨论”部分）。此外，Powell 和 Rosenthal15 就如何设计适当的实验，以及在动物行为研究中使用人工刺激可解决哪些问题，提供了建议。

由于制作计算机动画可能既困难又耗时，因此需要软件来简化并标准化动画设计流程。在本研究中，我们介绍了一款免费且开源的 FishSim 动画制作流程16 （简： FishSim https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/），一种结合生物学与计算机科学的跨学科方法，旨在满足上述需求。该方法与先前已发表的工具类似 anyFish17,18，工具链的开发旨在为研究人员提供一种简便易用的方法，以便在鱼类实验中实现动画3D刺激。我们的软件包含一系列工具，可用于：（1）创建3D虚拟鱼FishCreator），（2）使用视频游戏控制器为虚拟鱼的游动路径设置动画鱼类操控），以及（3）在显示器上向活体目标鱼组织并呈现预先录制的动画（FishPlayer）。我们的工具链提供了多种功能，特别适用于二选一情境下的测试，同时也可应用于其他实验设计。此外，通过动画模拟两条或更多虚拟鱼，可实现对群集行为或求偶行为的仿真。动画不受特定刺激限制，可与其他刺激重新组合播放，从而能够在改变刺激外观的同时保持其行为模式不变。该工具链的开源特性，以及其基于机器人操作系统ROS（www.ros.org）的设计，赋予系统高度模块化，几乎可以无限扩展以集成外部反馈设备（如控制器或追踪系统），并可根据研究需求灵活调整工具链配置。除帆鳍花鳉外，目前还可用于另外四个物种：大西洋花鳉 Poecilia mexicana，孔雀鱼 Poecilia reticulata，三刺鱼 Gasterosteus aculeatus 和一种慈鲷 Haplochromis spp. 新物种可在 3D 图形建模工具中创建（例如， Blender，www.blender.org)。以示例说明工作流程 FishSim 并以帆鳍花鳉为例，开展了一项案例研究，旨在提供一份利用计算机动画进行配偶选择模仿实验的操作方案。

配偶选择是动物在其生命史中所做出的最重要决策之一。动物已进化出多种策略以寻找最佳的交配伴侣。它们在独立评估潜在交配对象时，可能依赖于个体自身的信息，这种评估有时可能基于对特定表型性状的预先存在的遗传偏好19, 20。然而，它们也可能通过观察同种个体的配偶选择行为，从而利用公共信息21。如果观察者随后决定选择与先前被观察的同种个体——即“示范者”——相同的配偶（或相同表型），这种现象被称为配偶选择复制（下文简称为MCC）22,23。配偶选择复制是一种社会学习形式，因此属于非独立的配偶选择策略24，该现象已在脊椎动物25,26,27,28,29和无脊椎动物中均有发现30,31,32。迄今为止，MCC主要在鱼类中被研究，并已在实验室条件33,34,35,36,37,38和自然环境中得到证实39,40,41,42。当两个或多个潜在交配对象在质量上明显相似时，做出一个在适合度最大化意义上的“良好”配偶选择将变得困难，此时配偶选择复制对个体尤为有利43。示范雌性的自身质量可能会影响目标雌性是否复制其选择44,45,46,47。相应地，“高质量”或“低质量”的示范雌性通常被认为在配偶选择方面具有更多或更少的经验，例如与其体型和年龄相关44,45,46，或因其为同种或异种个体而异47。在会复制同种个体配偶选择行为的帆鳍花鳉中39,48,49,50,51，研究发现目标雌性甚至会复制对某一雄性的拒绝行为52。由于MCC被认为在表型性状的演化、物种形成及杂交过程中发挥重要作用21,23,53,54，复制一个“错误”选择所带来的后果可能极为严重，会显著降低复制者的适合度55。当个体决定复制另一个体的选择时，评估所观察的示范者是否为可靠的信息来源至关重要，i.e., 示范者自身是否因在配偶选择方面经验丰富而正在做出“良好”的选择。由此引出一个问题：在帆鳍花鳉雌性中，哪些视觉特征可能标志着一个值得复制的可靠示范者？

雌性帆鳍花鳉及其他花鳉科鱼类的一个显著视觉特征是妊娠斑（也称为“肛斑”、“育卵斑”或“怀孕斑”）。这一位于肛门区域的深色色素沉着区域源于卵巢囊壁组织的黑色素沉积56。妊娠斑的大小和存在在同种雌性个体间存在差异，并可能随着卵巢周期的进展而发生个体内的动态变化56,57。妊娠斑可能具有吸引雄性、协助交配时生殖足插入定位以实现体内受精58，或作为展示生育能力的信号59,60。鉴于妊娠斑与雌性繁殖状态之间的关联，我们推测妊娠斑可作为雌性模型质量的信号，向观察中的目标雌性提供其当前繁殖状态的信息。我们检验了两个相互替代的假设。第一，如果妊娠斑如Farr和Travis59所预测的那样是性成熟的普遍标志，则带有斑点的模型雌性相比未成熟模型（无斑点）更可能是可靠且有经验的示范者。在此情况下，目标雌性更倾向于模仿有斑点模型的选择，而不模仿无斑点模型的选择。第二，如果妊娠斑如Sumner et al.60所预测的那样标志着因已怀有胚胎而处于非接受状态，则该模型的可靠性可能较低，因为非接受状态的雌性通常被认为择偶标准较宽松。在这种情况下，目标雌性将不会模仿有斑点模型的选择，而更可能模仿无斑点模型的选择。迄今为止，妊娠斑在帆鳍花鳉雌性中的社会性信息传递（MCC）作用尚未被检验，也未进行过实验性操控。

我们使用 FishSim 通过在计算机显示器上呈现虚拟刺激雄鱼和虚拟模型雌鱼，而非采用经典实验程序中使用的活体刺激鱼和模型鱼，来开展一项 mate-choice copying（MCC）实验49,50,51,61。我们此前已验证该软件在测试帆鳍花鳉交配选择假说方面的通用性12。本研究中，我们检验了虚拟模型雌鱼是否存在 gravid spot（妊娠斑）会影响观察用活体焦点雌鱼的交配选择。首先，我们让焦点雌鱼适应测试水箱（图1.1），并在首次交配选择测试中让其在两个不同的虚拟刺激雄鱼之间进行选择（图1.2）。随后，在观察阶段，将此前未被偏好的虚拟雄鱼与一只虚拟模型雌鱼共同呈现（图1.3）。在随后的第二次交配选择测试中，焦点雌鱼再次在相同的两只雄鱼之间进行选择（图1.4）。我们通过比较焦点雌鱼在第一次和第二次交配选择测试中的选择决策，分析其是否复制了所观察模型雌鱼的交配选择。我们实施了两种不同的实验处理方式，通过视觉手段操控虚拟模型雌鱼的质量。在观察阶段，我们或者将此前未被偏好的虚拟雄鱼（1）与一只带有妊娠斑的虚拟模型雌鱼共同呈现（“有斑”处理）；或者（2）与一只不带妊娠斑的虚拟模型雌鱼共同呈现（“无斑”处理）。此外，在一个不提供任何模型雌鱼的对照组中，我们检验了在无公共信息条件下，焦点雌鱼的交配选择是否保持一致。

鱼类配偶选择实验示意图；装置包括液晶显示屏、虚拟雄性鱼、配偶选择区域。
图1. 使用虚拟鱼类刺激进行MCC实验的最重要实验步骤总体示意图。（1） 适应期。（2） 第一次配偶选择测试：活体目标雌鱼在虚拟刺激雄鱼之间进行选择。（3） 观察期：目标雌鱼观察先前未选择的雄鱼与一只带有怀卵斑的虚拟模型雌鱼在一起的情景。（4） 第二次配偶选择测试：目标雌鱼再次在虚拟刺激雄鱼之间进行选择。在此示例中，她模仿了模型个体的选择行为。请点击此处查看该图的高清版本。

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方案

实验操作及鱼类处理均符合德国动物福利法（Deutsches Tierschutzgesetz），并经锡根大学内部动物福利官员乌尔斯·吉塞尔曼博士（Dr. Urs Gießelmann）以及锡根-维特根施泰因县兽医局（Kreisveterinäramt Siegen-Wittgenstein）批准（许可证编号：53.6 55-05）。

1. 虚拟鱼类设计

注意： 所需硬件和软件的清单请见补充材料列表。FishSim 的总体功能详细说明以及更多使用技巧详见用户手册（https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/）。

  1. 制备带有和不带有妊娠斑的雌性鱼体纹理
    1. 启动 GIMP，然后点击 文件 >> 打开，从目录“fishsim_animation_toolchain”中的 models 文件夹打开雌性鱼体纹理图像“PLF_body_6.png”。将此图像作为所有新创建的带有妊娠斑的雌性鱼体纹理的参考。使用 自由选择工具 选中参考图像中的深色妊娠斑区域，并将其剪切（点击 编辑 >> 剪切）。
      注意：GIMP（可在 www.gimp.org 获取）是一款免费的图像编辑工具，类似于 Adobe Photoshop，可用于处理数字图像和图形。
    2. 在 GIMP 中打开第二个雌性鱼体纹理文件（例如，“PLF_body_7.png”），通过插入先前剪切的斑点区域（点击 编辑 >> 粘贴到选区中）作为新的浮动图层，将其转移到第二个体纹理上。调整第二个图像中妊娠斑的位置，并通过点击 图层 >> 锚定图层 合并图层。
      注意：确保妊娠斑在每个虚拟模型雌鱼上的大小相同且位置一致（图2）！
    3. 将新创建的“有斑”纹理以新名称（例如，PLF_body_7_S.png）导出（文件 >> 另存为）至 models 文件夹中。关闭 GIMP 中所有打开的图像窗口。
      注意：不要对纹理文件进行任何其他更改（例如 缩放），因为这些文件已特别编辑，以便后续映射到三维鱼模型上。
    4. 使用相同的原始雌性鱼体纹理文件再次创建第二个不带妊娠斑的体纹理（例如，“PLF_body_7.png”）。现在，借助 GIMP 覆盖原始文件中已存在的妊娠斑。
    5. 在 GIMP 中打开雌性鱼体纹理，选择 克隆工具。按住 Ctrl + 左键单击 选择腹部周围区域的纹理图案（无深色色素沉着），然后使用该选区通过克隆工具涂抹覆盖已有的深色色素区域（图2）。
    6. 将新创建的“无斑”纹理以新名称（例如，PLF_body_7_NS.png）导出至 models 文件夹中。关闭 GIMP。

用于研究的鱼类纹理处理；原始、有斑点、无斑点处理的对比图。
图 2：使用图像编辑工具 GIMP 对雌性鱼体纹理进行处理前（原始）及处理后“有斑点”和“无斑点”处理的示例图片。 虚线圆圈标示了被处理的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 调整视点并设置动画的“场景”
    1. 开始 FishSim 通过选择 FishSim 桌面左侧启动器中的图标. 设置演示显示器的分辨率，然后单击 启动.
      注意： 建议在其中一个展示显示器的屏幕上进行以下调整（步骤1.2.2‒1.2.4）（当显示器的尺寸和分辨率不同时）。
    2. 按压 F1 在键盘上按以从查看模式切换到编辑模式（通过重复按压在查看模式与编辑模式之间切换） F1).
      注意： 切换到编辑模式后，窗口顶部将显示编辑工具栏。查看模式中显示的场景即为实验过程中屏幕上呈现的内容。
    3. 通过调整摄像机角度，使视图与显示监视器的尺寸相匹配。按住鼠标左键并移动光标以旋转摄像机。按住鼠标右键并移动光标以平移摄像机。按住鼠标中键（或同时按住两个鼠标按钮）并移动光标以实现摄像机的缩放。
    4. 点击 相机设置 在编辑工具栏中（相机图标）并单击 复制到静态摄像头 设置视点。单击 文件 >> 保存场景 将调整后的场景保存为新的默认场景。为此， 覆盖 “default_scene.scene”文件中的 场景 文件夹中的 FishSim 目录
      注意： 每次启动时将显示默认场景 FishSim 以及作为起始场景 FishPlayer。在 FishPlayer 默认场景在实验过程中还可起到暂停的作用（图3A）。调整场景只需进行一次。

鱼类运动行为；水族箱；显示位置变化的连续图像序列
图3：FishSim 中某一场景的截图。(A) 未添加鱼的空白默认场景，(B) 显示一条雄鱼单独存在的场景，(C) 显示同一条雄鱼与带斑点的模型雌鱼共存的场景，以及 (D) 显示同一条雄鱼与无斑点的相同模型雌鱼共存的场景。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 用于交配选择测试中呈现的虚拟雄性刺激设计
    注意： 准备虚拟雄性刺激材料，随后将其动画化，并在交配选择实验中呈现给活体目标雌性。
    1. 如果尚未打开，请启动 FishSim. 按压 F1 进入编辑模式。
    2. 点击 文件 >> 加载鱼模型 从下拉菜单中选择并加载默认的雄性帆鳍花鳉模板“default_PLM.x” 通过从文件夹中选择它 模型
    3. 左键双击已加载的鱼以选中它，选中的鱼将用网格高亮显示。点击工具栏中的齿轮图标以打开鱼工具集，此时会弹出一个包含编辑选项的对话框，用于自定义虚拟雄鱼。取消勾选 显示网格 以便更清楚地观察鱼类。
    4. 改变 名称 到 雄性.
      注意： 这 名称 雄性个体的特征非常重要，代表了其在后续动画过程中将要扮演的“角色”。 名称 在后续实验中使用的每一个新创建的虚拟男性，其参数必须完全相同。
    5. 改变 比例尺 （尺寸）通过修改 x、y 和 z 的值来调整雄性个体的大小（如有需要），然后单击 应用.
    6. 通过点击编辑男性的纹理 纹理 在 编辑工具栏单击鱼类的某个部位（身体、背鳍、尾鳍）以进行修改。
      注意： 这 选择一种纹理 框中将弹出所有可用作纹理的 .png 文件。纹理将按其在原始文件中指定的名称显示 模型 文件夹
    7. 单击列表（右侧）中显示的纹理，该纹理将直接出现在鱼体上，并替换之前的纹理。
    8. 当获得所需雄性个体后，单击 应用 在……下方 配置 在 编辑工具栏，然后单击 将鱼类数据保存至磁盘. 将新雄鱼保存为“Male_A.fish”在 模型 文件夹
    9. 此外，保存整个场景（文件 >> 保存场景）包括其中一只雄性 场景 文件夹。此处建议使用名称“Male_A_alone.scene” （图3B）).
    10. 点击 文件 >> 加载场景 加载空的默认场景，重复步骤 1.3.2 至 1.3.9，根据需要创建尽可能多的不同虚拟雄性个体，并将每个新创建的雄性个体以唯一名称保存在 模型 文件夹中，并作为新的 .scene 文件 场景 文件夹
  2. 用于观察期间展示的虚拟雌性鱼类模型设计
    1. 点击 文件 >> 加载场景 加载默认场景。按照步骤 1.3.1 操作并点击 文件 >> 加载鱼模型 加载默认的女性模板“default_PLF.x” 模型 文件夹
    2. 左键双击已加载的雌鱼以选中，并打开鱼类工具集。将名称更改为“female”。如有需要，按照步骤1.3.5中的说明调整雌鱼的大小。
      注意： 名称和比例尺在本实验中所有雌性个体之间应保持一致。
    3. 将默认的女性身体纹理替换为先前创建的“spot”身体纹理（位于右侧框中），具体操作如步骤1.3.6至1.3.7所述。
    4. 点击 应用 在……下方 配置 在 编辑工具栏，然后通过点击将鱼类保存到磁盘 保存 并创建一个文件“Female_1S.fish”（S = spot）。
    5. 点击 文件 >> 加载场景 加载默认场景。重复步骤 1.4.1 至 1.4.4，创建至少一个（或根据需要创建多个）相同的雌性模型，但不包含妊娠斑，并将其命名为“Female_1NS.fish”（NS = 无斑）。将每条鱼保存在 模型 文件夹.
      注意： 在MCC实验的观察期内，必须创建并保存包含一名男性和一名女性的场景。
    6. 点击 文件 >> 加载场景 加载空的默认场景。单击 文件 >> 加载鱼类模型 插入一个来自虚拟雄性“Male_A.fish”的 模型 文件夹。单击 文件 >> 加载鱼模型 再次将虚拟模型雌鱼“Female_1S.fish”添加到场景中。通过调整每条鱼的x、y和z坐标来改变其位置，确保它们的身体不相互重叠。
      注意： 通过双击该鱼并按下按键来将其从场景中删除 删除 在键盘上。
    7. 保存 通过点击包含男性和模型女性的场景 文件 >> 保存场景 如“Male_A_with_Female_1S.scene”（图3C).
    8. 重复步骤 1.4.6 至 1.4.7，另创建三个场景：（1）Male_A 与 Female_1NS（参见 图3D），（2）Male_B 与 Female_1S，以及（3）Male_B 与 Female_1NS。

2. 虚拟鱼刺激的动画

注意： 实验所需每种类型的动画只需使用一个示例雄性场景和一个示例观察场景（雄性和雌性一起动画）制备一次即可。在动画制作过程中，会为每条鱼创建一条游动路径，之后只要名称相同，任何鱼都可以重播该路径（参见步骤 1.3.4）。

  1. 用于交配选择测试中展示的虚拟雄性动画
    注意： 准备两个虚拟男性的动画：（1）持续时间为7.5分钟的游泳路径，（2）持续时间为5分钟的游泳路径。
    1. 插入游戏控制器（例如， 将索尼Play Station 3插入操作计算机的USB端口。
    2. 开放 FishSim 并点击 文件 >> 加载场景 从文件夹中加载一个男性的场景 场景, 例如， “Male_A_alone.scene”。开始 鱼类操控 通过点击 鱼类操控 图标。
    3. 在单独的窗口中配置控制器设置。
      注意： FishSim 和 鱼类操控 可同时运行，鱼类可在观察模式下进行操控，如实验中所示，或通过按下按键切换至编辑模式进行操控 F1.
    4. 要使（雄性）鱼动画化，请从下拉菜单中选择该鱼 转向 面板。此处的模型名称对应于所给出的名称 编辑工具栏 （参见步骤 1.3.4）。
    5. 点击 开始放置 使用控制器将鱼放置在虚拟水箱中的任意起始位置。点击 停止放置.
    6. 点击开始记录鱼的游泳路径 开始记录. 使用控制器在场景中移动鱼。
      注意： 记录时长显示在控制面板的右下角。
    7. 点击 停止录制. 点击 保存 将游泳路径保存为 .bag文件 （驱动器上的“记录”）例如， 在桌面上）。选择文件名以表示记录的持续时间， 例如， “7_30_min_male_alone.bag”
      注意： 一旦停止录制，便无法再次编辑总时长。
    8. 在求偶选择测试中，编辑录像以添加雄性背鳍的运动，模拟雄性求偶行为。从下拉菜单中选择背鳍 编辑 功能（每次只能编辑一个功能）。
    9. 选择 开始编辑 并完整重放游泳路径。在控制器上按下 L1 按钮，可在特定时间点抬起背鳍。点击 保存 将编辑后的游泳路径保存为新版本 .bag文件
    10. 重复步骤 2.1.8 和 2.1.9，但选择生殖足以添加其运动。保存最终版本以供后续使用 FishPlayer关闭 鱼类操控
      注意： 建议为每个编辑步骤的 bag 文件保存唯一的名称。这样，如果编辑过程中出现问题，始终可以返回到动画的早期版本。
  2. 观察期间用于展示的虚拟雄性与模型雌性动画
    注意： 准备一段持续10分钟的动画，其中虚拟雄性与虚拟雌性模型进行求偶行为，彼此发生性互动。
    1. 开放 FishSim 按压 F1 进入编辑模式并点击 文件 >> 加载场景 加载包含男性和女性的场景， 例如， “Male_A_with_Female_1S.scene”。开始 FishSteering
    2. 交替选择雄性和雌性并放置（通过点击） 开始/停止放置虚拟水箱中的）
    3. 录制时，首先从下拉菜单中选择雌性鱼 转向 面板，并按照步骤 2.1.5 至 2.1.6 创建持续时间为 10 分钟的游泳路径。
      注意： 一次只能记录一条鱼的游泳路径。在完成第一条鱼的动画后，可以使用以下方法加入第二条鱼的游泳路径 编辑 功能，同时先前已操控的鱼将在整个动画持续期间一同重播。
    4. 点击 停止录制 和 保存 驱动路径上的游动轨迹， 例如， 命名为“10_00_min_male_with_female.bag”。随后按照步骤2.1.8至2.1.10所述，依次编辑雄鱼的游泳路径、背鳍运动和生殖足运动。 保存 后续使用时的最终版本 FishPlayer.

3. 为 MCC 实验准备动画播放列表

注意：使用 FishPlayer 在两个显示器上向活体目标雌鱼呈现动画。为每个显示器分别设置播放列表，以模拟 MCC 实验的流程（图1）。该工具包含一个主窗口，用于显示每个显示器的播放列表记录（图4），以及为每个显示显示器设置的独立动画窗口。

  1. 场景与记录的通用功能及布局
    1. 关闭所有窗口并打开 FishPlayer 通过单击相应的图标进行设置。将系统配置为使用两个显示器进行演示（左侧和右侧），然后单击 启动.
      注意： 步骤1.2.4中创建的默认场景（保存在 默认场景.scene）将始终作为起始画面并在暂停命令期间在两个显示器上加载和显示。
    2. 分别为每个显示器向播放列表中添加条目。点击 添加加载场景 添加场景 例如， 男性A，来自 场景 文件夹中的 FishSim 目录。单击 添加播放记录 从驱动器添加记录， 例如， 男性单独完成的7.5分钟记录。
      注意： 场景与后续记录将由软件进行关联，场景中所呈现的虚拟男性将根据相应记录中的定义进行动画呈现。
    3. 点击 添加暂停 添加一个特定时长（分钟/秒）的暂停指令，在记录间歇期间显示无鱼的默认画面，以便进行鱼类操作。
      注意： 暂停时长通常应根据处理鱼类所需的时间而定。单击条目并拖动可更改其在列表中的顺序。所选条目以红色标记。通过选择条目并点击，可从播放列表中删除该条目 删除所选内容
    4. 点击 播放/停止 开始和停止演示。 停止 将始终播放完整播放列表， 例如， 一旦播放列表开始运行，无法在中途暂停。
      注意： 播放列表始终从第一个条目开始，自上而下依次播放。因此，所有条目的正确顺序必须在实验开始前设定，一旦开始播放，无法在不中断播放的情况下进行更改。窗口底部的计时器显示当前播放列表的总时长和实时播放时间。
  2. MCC实验中两种处理组与对照组的播放列表排列方式
    注意： 就入口排列而言，MCC实验分为两部分：（1）第一次择偶选择测试，以及（2）观察期后进行第二次择偶选择测试。因此，针对每种处理组和对照组，播放列表需按两种不同的顺序进行编排。
    1. 进行实验时，首先为第一次配偶选择测试准备一个播放列表。
    2. 其次，在实验进行过程中，根据目标雌性在第一次配偶选择实验中对虚拟雄性的偏好，调整后续观察阶段及第二次配偶选择实验的播放列表顺序。
  3. “点”治疗的特定播放列表排列
    1. 在处理1的第一次交配选择测试中，将播放列表的顺序严格按照图示排列 图
    2. 第一次交配选择测试结束后，暂停以计算雌性更偏好的虚拟雄性个体（见下文步骤5.9）。随后重新排列观察阶段的播放列表，在该阶段通过向目标雌性展示先前未被偏好的雄性与模型雌性的组合，为其提供公共信息。
    3. 根据观察用播放列表和接下来的第二次配偶选择测试进行安排 图5.
    4. 在观察期内，将雄性与模型雌性共处10分钟的记录与此前该雄性单独出现的画面进行衔接。
      注意： 在此情况下，仅显示雄性的游泳路径，且由于场景中缺少虚拟雌性模型，该模型将不出现。
    5. 对于展示非偏好雄性的播放列表，将10分钟的录像与包含先前非偏好雄性及模型雌性的场景链接。本处理组应选择包含具有 gravid spot（S）的模型雌性的场景。
      注意： 与3.3.2节不同的是，此处将重放相同的录像，但模型雌性个体此时是可见的。

FishPlayer software interface; two playback panels for scene control in behavioral study setup.
图4：显示的截图 FishPlayer 第一部分中左侧和右侧显示器的播放列表（即， MCC实验中的第一次择偶选择测试 处理1中首次交配选择测试所需的播放列表条目按所需顺序排列。 请点击此处以查看此图的放大版本。

FishPlayer 界面示意图；播放控制、场景加载、播放列表管理、时间设置。
图 5：显示 MCC 实验第二部分（观察期和第二次配偶选择测试）中左右显示器所用 FishPlayer 播放列表的截图。 播放列表条目已按照处理方式 1 中观察期和第二次配偶选择测试的需要进行排序。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. “无斑点”处理的特定播放列表排列
    1. 对于处理2，播放列表的顺序按处理1所述进行（图4 和 图5），但在观察期间改用包含无妊娠斑点的虚拟模型雌鱼（NS）的场景。
  2. 用于选择一致性对照的特定播放列表排列
    注意：在选择一致性对照中，配偶选择测试的播放列表条目与处理1和处理2相同（图4）。然而，在观察期间，不向目标雌鱼提供任何公共信息，因此模型雌鱼不可见。
    1. 按 图5 所示顺序排列播放列表，但将每条雄鱼单独的场景与其10分钟录像合并。
      注意： 此情况下，仅显示雄鱼的游动路径，由于场景中缺失，两侧均无模型雌鱼。

4. 实验设置

  1. 将两台电脑屏幕分别放置在测试水箱的两端。调整屏幕位置，使其覆盖测试水箱大部分玻璃壁，并确保屏幕与水箱壁之间留有 1.5 cm 的间隙。从上方为水箱提供照明。
  2. 在水箱底部铺上一层薄薄的碎石，并注入适合活鱼生存的水，水位高度与屏幕齐平。在水箱外侧两端各距 20 cm 深度处用垂直线标记出选择区域。准备一个亚克力玻璃圆筒和两块秒表备用。
  3. 将显示器连接至电源和操作计算机，计算机应放置在距离测试水箱至少 1 m 的位置，例如，放在一张小桌上（图 6）。

行为学实验装置示意图；包含鱼的水箱、显示刺激的显示器、计算机控制系统。
图6：使用计算机动画的MCC实验装置示意图。 操作计算机连接至两个显示屏幕（显示器1和显示器2），用于向测试水箱内的目标雌鱼播放动画。为便于说明，两个液晶显示器均以一定角度放置，以展示动画场景。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 进行MCC实验

注意：请按照以下实验步骤，使用一只活的焦点雌性个体进行一次处理1、处理2或对照MCC实验（见图1）。

  1. 打开 FishPlayer 在操作计算机上排列播放列表 首次配偶选择实验 作为 例如， 治疗1所述（图4）。检查用于呈现的显示器是否正在运行，并确认其显示为空的默认场景。
  2. 将一只活的焦点雌性放入测试水箱中，使其自由游动，并适应水箱环境以及两侧显示器上空水箱的呈现，适应时间为20分钟。
  3. 适应环境后，将目标雌性个体放入测试水箱中央的一个透明亚克力圆筒中，确保其到两个显示器的距离相等，然后通过点击同时在两个显示器上运行播放列表 播放，从第一次交配选择实验开始。
    注意： 将焦点雌性个体置于圆柱体内，使其观察两个虚拟刺激雄性个体，持续约2.5分钟。
  4. 在计时器到达 02:30 min 之前，缓慢走向实验水箱，并通过轻轻将圆筒垂直提出水面的方式，释放其中的目标雌鱼， 例如， 02:15 分钟时
    注意： 此处的精确时间取决于操作计算机与测试水箱之间的距离，应在预实验中确定。操作时必须缓慢轻柔，以避免对鱼类造成应激。由于鱼类行为可能非常迅速，建议在释放雌鱼的同时即准备好一个秒表，以便立即开始测量关联时间（见步骤6.1）。
  5. 返回操作计算机。观察目标雌性个体，并准备好两块秒表 测量结合时间 与每个虚拟刺激雄性个体（见步骤6.1）。
    注意： 让目标雌性自由游动，并在两只雄性之间选择，持续5分钟。
  6. 当计时器达到 07:30 min 时，停止测量关联时间。随后暂停 1.5 min。利用暂停时间进行操作，将目标雌性再次放入圆筒中，并在数据记录表上记下每只虚拟雄性的时间。
    注意： 暂停后，将开始第二段7分30秒的记录，此时目标雌性可同时观察两侧的雄性7分30秒。为控制目标雌性可能存在的侧向偏好，雄性左右位置在此阶段已互换（参见步骤6.3）。
  7. 在计时器到达11分30秒之前，释放中心雌性个体。随后测量接下来5分钟内的关联时间。
  8. 当计时器达到16分30秒时，停止测量关联时间。暂停记录将持续1分钟。利用此操作时间将目标雌性放入圆筒内。
  9. 记录第二次测量的关联时间。对每只雄性个体，汇总首次配偶选择实验中两个阶段（雄性交换前后）的关联时间总和。计算目标雌性是否存在侧向偏好，以及目标雌性偏好的雄性个体（参见步骤6.1至6.3）。
    注意： 如果暂停在计算完成前结束，也没有问题，因为进入下一步需要播放列表到达末尾并停止。
  10. 重新排列播放列表（操作） 不 关闭 FishPlayer!) 如图所示 图5 （根据当前处理条件）在观察期间，先前偏好的雄性将单独被激活，而先前非偏好的雄性将与虚拟雌性模型一同被激活。
    注意： 焦点雌性无法看到播放列表所做的更改。
  11. 点击 播放 继续实验的第二部分，条目将从顶部到底部依次重播，首先从 10分钟观察期.
    注意： 在观察期间，目标雌性个体停留在圆柱体内，但能够观察到两个展示。
  12. 观察期结束后，开始0.5分钟的暂停。在计时器到达10分30秒之前，释放中心雌性个体，并开始 第二次配偶选择测试 记录每只雄性动物5分钟内的行为，随后测量接下来5分钟内的相互接触时间。
  13. 当计时器达到15分30秒时，停止测量关联时间。随后暂停记录1.5分钟。将目标雌性放入圆筒内，并记录其对每个虚拟雄性的测量时间。
    注意： 暂停后，接下来的7分30秒片段将开始播放，焦点雌性可观察两只雄性（左右位置再次互换）2.5分钟。
  14. 在计时器到达19分30秒之前，释放中心雌性个体，记录最后5分钟的伴随时间。
  15. 当计时器达到24分30秒时，停止测量结合时间 终止实验记录两个虚拟雄性的关联时间，并继续进行分析。

6. 数据测量

  1. 在每次配偶选择实验的第一阶段和第二阶段（刺激物切换前和切换后），当目标雌性在两只雄性之间进行选择时，测量其关联时间。
    注意： 当雌性以头部和鳃盖越过限定选择区域的边界线时开始计时；当其头部和鳃盖完全离开选择区域时停止计时。
  2. 汇总每次配偶选择实验中目标雌性在第一阶段和第二阶段与每只雄性的关联时间，并确定其偏好的雄性。
    注意： 若目标雌性在一次配偶选择实验中，于两个选择区域内与某一只雄性共处的时间超过总时间的50%，则判定该雄性为被偏好的个体。在数据分析中，关联时间通常转换为偏好得分（相对配偶选择值），其定义为目标雌性与某一只雄性共处的时间除以她在选择区域内与两只雄性共处的总时间。
  3. 计算目标雌性在第一次配偶选择实验中是否存在侧向偏好，并将存在偏好的个体从最终分析中剔除。
    注意： 若目标雌性在第一次配偶选择实验的两个阶段中，即使在雄性位置互换后，仍于同一选择区域停留超过总时间的90%，则认为其存在侧向偏好。此时其对雄性的选择被视为受侧向偏好影响，该次实验随即终止。
  4. 测量每只目标雌性的标准体长（SL）。
    注意： 为避免实验过程中鱼类受到应激，所有测量均在实验结束后进行。

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结果

按照实验方案，我们使用 FishSim 创建了虚拟帆鳍花鳉雄性和雌性的计算机动画。随后，我们利用该工具链在二选一的情境下向活体目标雌鱼呈现这些动画，根据协议中所述的实验流程以及图1和步骤5进行MCC实验。

为了确定焦点雌性是否模仿虚拟模型雌性的选择，我们在实验过程中测量了焦点雌性在第一次和第二次交配选择测试中对每只雄性的关联时间。通常使用各处理组和对照组在第一次及第二次交配选择测试中获得的关联时间来分析多个参数，以评估选择的一致性。数据分析方法并不局限于特定的统计检验，而可通过多种方式进行（例如，参数/非参数检验、重复测量方差分析、统计模型），并可能取决于最终的数据结构。在本研究的数据分析中，我们使用了 R 3.2.262。我们将实验中获得的原始数据以及用于分析的 R 代码上传至 Figshare（doi: 1...

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讨论

既往研究认为，帆鳍花鳉雌性个体的妊娠斑可能是向同种雄性展示生育力的一种信号59,60。然而，妊娠斑是否也能在雌性间的配偶选择过程中为同种雌性提供信息，此前尚未得到检验。在本案例研究中，我们探讨了妊娠斑在多雌性选择（MCC）情境下，作为同种观察雌性获取公共信息来源的潜在作用。本研究表明，在决定是否模仿虚拟示范雌性对某一虚拟雄性的配偶选择时，妊娠斑似乎并非活体焦点雌性判断示范雌性质量的标志。无论示范雌性是否具有妊娠斑，焦点雌性均会模仿其对先前非偏好的虚拟雄性的选择。我们在两种处理条件下未发现模仿得分或配偶选择逆转次数的差异，表明无论示范雌性是否具有妊娠斑，其模仿效应的强度均相当。在对照组中未提供公共信息（即无示范雌性存在）时，焦点雌性在配偶选择上保持一致。这支持了实验中各处理组内偏好变化仅可归因于虚拟示范雌性的存在，即后者提供了足以引发模仿他人配偶选择行为的充分公共信息。

尽管通常认为妊娠斑的存在及其明显程度与雌性个体的生殖周期相关，即在分娩前最大，分娩后最小或消失

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG）资助（项目编号：WI 1531/12-1，受助人：KW 和 SG；项目编号：KU 689/11-1，受助人：KDK、KM 和 JMH）。我们衷心感谢德国学术交流中心（DAAD）RISE 德国项目为 SG 与 DB 之间提供的本科研究实习机会并协助组织安排（资助编号：57346313）。我们感谢 Mitacs 为 DB 提供 RISE-Globalink 研究实习奖学金（FR21213）。我们诚挚感谢 Aaron Berard 邀请我们向 JoVE 读者介绍 FishSim，并感谢 Alisha DSouza 以及三位匿名审稿人对本文先前版本提出的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硬件
2台19" Belinea LCD显示器Belinea GmbH，德国型号1970 S1-P分辨率为1280 x 1024像素
1台24" Fujitsu LCD显示器Fujitsu Technology Solutions GmbH，德国型号B24-8 TS Pro分辨率为1920 x 1080像素
计算机Intel Core 2 Quad CPU Q9400 @ 2.66GHz × 4，GeForce GTX 750 Ti/PCIe/SSE2，7.8 GiB内存，64位，1TB；配备键盘和鼠标
SONY Playstation 3无线控制器Sony Computer Entertainment Inc.，日本型号CECHZC2E通过USB线缆连接至计算机
玻璃水族箱100 cm × 40 cm × 40 cm（长×高×宽）
有机玻璃圆筒定制高49.5 cm，壁厚0.5 cm，直径12 cm；在圆筒末端附近钻有八个直径约5 mm的小孔，以减少释放鱼类时的水流扰动
砾石
2台OSRAM L58W/965OSRAM GmbH，德国用于实验装置的照明
2个秒表
名称公司目录编号备注
软件
ubuntu 16.04 LTS计算机操作系统；可从以下网址下载：https://www.ubuntu.com/
FishSim Animation Toolchain v.0.9软件及用户手册（PDF）可从以下网址下载：https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain
GIMP Gnu图像处理程序（版本2.8.22）可从以下网址下载：https://www.gimp.org/

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