用于靶向质粒DNA递送的甲硫氨酸功能化生物相容性嵌段共聚物

摘要

本研究通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）方法制备了甲硫氨酸功能化的生物相容性嵌段共聚物（mBG），并考察了所得mBG与质粒DNA的复合能力及其转染效率。RAFT方法在聚合含有特殊官能团的单体方面具有显著优势。

摘要

可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合结合了自由基聚合与活性聚合的优点。本研究介绍了通过RAFT聚合制备蛋氨酸功能化生物相容性嵌段共聚物的方法。首先， N,N-二(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺-b-N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺（BNHEMA-b-APMA，BA）通过RAFT聚合反应合成，以4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)（ACVA）作为引发剂，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯（CTP）作为链转移剂。随后， N,N-双(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺-b-N-(3-胍丙基)甲基丙烯酰胺（甲硫氨酸接枝的BNHEMA）b通过在APMA中引入甲硫氨酸和胍基对胺基进行修饰，制备了-GPMA, mBG。为进行比较，合成了三种类型的嵌段聚合物mBG1、mBG2和mBG3。采用茚三酮反应定量测定APMA含量；mBG1、mBG2和mBG3中APMA含量分别为21%、37%和52%。凝胶渗透色谱（GPC）结果显示，BA共聚物的分子量分别为16,200（BA1）、20,900（BA2）和27,200（BA3）g/mol。同时研究了所得嵌段共聚物基因载体与质粒DNA（pDNA）的复合能力。当pDNA分别与mBG1、mBG2、mBG3完全复合时，电荷比（N/P）分别为8、16和4。当mBG/pDNA聚集体的N/P比大于1时，mBG的Zeta电位呈正值。在N/P比为16至32范围内，mBG/pDNA聚集体的平均粒径为100–200 nm。总体而言，本研究展示了一种简单且便捷的嵌段共聚物载体合成方案。

引言

近年来，基因治疗作为一种将核酸作为药物递送以治疗各类疾病的方法已逐渐兴起¹。质粒DNA（pDNA）和小干扰RNA（siRNA）等基因药物的开发依赖于药物递送系统（DDS）的稳定性和效率²。在所有DDS中，阳离子聚合物载体具有稳定性好、免疫原性低以及制备和修饰简便等优势，因而展现出广阔的应用前景^3,4。在生物医学的实际应用中，研究人员必须寻找具有高效性、低毒性且具有良好靶向能力的阳离子聚合物载体⁵。在所有聚合物载体中，嵌段共聚物是最广泛应用的药物递送系统之一。由于嵌段共聚物具有自组装特性，能够形成胶束、微球和纳米粒子，因此在药物递送领域受到广泛研究⁵。嵌段共聚物可通过活性聚合或点击化学方法合成。

1956年，Szwarc 等人提出了活性聚合的概念，将其定义为不发生链断裂反应的聚合过程^6,7。自那时以来，已发展出多种利用该方法合成聚合物的技术，因此活性聚合被视为高分子科学的一个里程碑⁸。活性聚合可分为活性阴离子聚....

方案

1. BNHEMA 聚合物（PBNHEMA）的合成

1. 在聚合瓶中，将 1.87 g 的 N, N-双(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺 (BNHEMA) 溶解于 1 mL 蒸馏水中。
   注：聚合瓶是一种带有橡胶塞和磁力搅拌子的圆底烧瓶。
2. 在 5 mL 烧杯中，将 0.03 g 的 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯 (CTP) 和 0.02 g 的 4,4’-偶氮二(4-氰基戊酸) (ACVA) 溶解于 0.5 mL 的 1,4-二氧六环中。然后，将 CTP 和 ACVA 溶液加入第 1.1 步的聚合瓶中。
3. 通过三次冷冻-抽气-解冻循环，用氮气对聚合瓶中的反应体系进行排气处理。
   1. 具体操作如下：使用冷凝阱将聚合瓶中的溶液冷冻，将聚合瓶固定在铁架台上，通过带有针头的导管（#9 针头，内径 0.65 mm，外径 0.9 mm）对反应混合物进行抽真空并通入氮气。密封聚合瓶后，在室温下解冻溶液 30 分钟。
   2. 重复冷冻-抽气-解冻循环三次。
4. 将聚合瓶放入 70 °C 的油浴中，在氮气氛围下反应 24 小时。
5. 将聚合瓶在 0 °C 下冷却，打开橡胶塞以终止聚合反应。
6. 将丙酮在 -20 °C 冰箱中预冷 2 小时，然后按 50:1 (v/v) 的比例与第 1.5 步的反应溶液混合。随后，在 8,200 × g....

结果

根据表1所示的目标聚合度加入BNHEMA；mBG的合成步骤如图1所示。首先，在水-二氧六环体系中，以4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯为链转移剂，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）法合成BNHEMA均聚物。其次，将PBNHEMA作为链转移剂，用于制备BNHEMA-b-APMA嵌段共聚物。APMA单体的加入量依据表1所示的目标聚合度确定。采用凝胶渗透色谱法（GPC）检测不同投料比下BA的分子量（表1）。通过茚三酮法测定不同投料比BA中APMA链的实际摩尔含量（表1）。根据我们先前的研究⁵，本研究选用mBG3，因其APMA含量最高。最后，将甲硫氨酸接枝到APMA链上，并将剩余的氨基完全胍基化，从而制备得到mBG。图2为mBG的¹H NMR数据。在N/P比为16时，mBG/pDNA聚集体的平均粒径和Zeta电位.......

讨论

本研究介绍了一系列BNHEMA-b-APMA嵌段聚合物阳离子基因载体。这些嵌段聚合物通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）方法合成。引入亲水性片段BNHEMA以提高溶解性。通过修饰甲硫氨酸和胍基以增强靶向能力与转染效率⁵。APMA链段含量的增加以及mBG共聚物中的胍基化作用降低了mBG/pDNA聚集体的粒径。该复合物的粒径和表面电位使其易于穿越细胞膜，适用于基因转染。实验的关键点在于严格控制BNHEMA单体与CTP的摩尔比为45:1，CTP与ACVA的摩尔比为2:1，反应温度为70 °C。在纯化过程中，预冷丙酮与聚合物溶液的体积比必须高于50:1。

在相同的N/P值下，随着APMA链比例的增加，mBG/pDNA复合物的粒径减小。这些结果表明，增加APMA链含量以及胍基化能够降低复合物的粒径。粒径和表面电位使该复合物易于穿越细胞膜，适用于转染。采用凝胶电泳研究了复合物形成与N/P比之间的关系，数据显示最小N/P比为4。本研究将为阳离子基因载体的进一步研究提供有价值的基礎数据。然而， BNHEMA-b-APMA不.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-羟基苯并三唑	Macklin Biochemical Co., Ltd,中国	H810970	≥97.0%
1,4-二氧六环	国药集团化学试剂有限公司，中国	10008918	AR
1-氨基脒基吡唑盐酸盐	阿拉丁有限公司，中国	A107935	98%
1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐	阿拉丁有限公司，中国	E106172	AR
4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)	阿拉丁有限公司，中国	A106307	分析纯（AR）
4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫代)戊酸	阿拉丁有限公司，中国	C132316	>97%(HPLC)
乙酸盐	国药集团化学试剂有限公司，中国	81014818	AR
丙酮	国药集团化学试剂有限公司，中国	10000418	AR
琼脂糖	阿拉丁有限公司，中国	A118881	高分辨率
抗坏血酸	阿拉丁有限公司，中国	A103533	AR
DMSO	阿拉丁有限公司，中国	D103272	AR
乙二醇	阿拉丁有限公司，中国	E103319	AR
N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐	阿拉丁有限公司，中国	N129096	≥98.0%(HPLC)
N,N-双(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺	载琪生物科技有限公司，中国	CF259748	≥98.0%(HPLC)
茚三酮	阿拉丁有限公司，中国	N105629	AR
PBS缓冲液	阿拉丁有限公司，中国	P196986	pH 7.4
质粒DNA	百奥格有限公司，中国	pDNA-EGFP	pDNA-EGFP
质粒DNA	百奥格有限公司，中国	Pdna	pDNA
十水合碳酸钠	阿拉丁有限公司，中国	S112589	AR
三甲胺	阿拉丁有限公司，中国	T103285	AR