يصف لنا إجراء معدني بسيط للتثبيت جزيئات الحمض النووي الجيني-طول على سطح، التي يمكن استخدامها للقيام بتجارب تعبير الجينات الخلية الحرة في بيوتشيبس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسمح التثبيت جينات على السطوح ليثوجرافيكالي منظم دراسة الجينات المجزأة عمليات التعبير في نظام مفاعل حيوي موائع جزيئية مفتوحة. على النقيض من النهج الأخرى نحو النظم الخلوية مصطنعة، يسمح هذا إعداد لإمداد متواصل مع الكواشف التعبير الجيني وتجفيف متزامنة من منتجات النفايات. وهذا يسهل تنفيذ عمليات التعبير الجيني الخلية الحرة على مدى فترات طويلة من الزمن، هو أمر مهم لتحقيق نظم التغذية المرتدة التنظيمية الجينات الحيوية. هنا نقدم بروتوكول مفصل لتلفيق الوراثية بيوتشيبس استخدام بسيط باستخدام معدني أسلوب استناداً إلى ردود فعل التشرد حبلا الحمض النووي، الذي يستخدم حصرا المكونات المتوفرة تجارياً. نحن نقدم أيضا بروتوكول على إدماج الجينات المجزأ مع بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)-على أساس نظام موائع جزيئية. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن النظام متوافق مع انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية، التي يمكن أن تستخدم للمراقبة المباشرة للتفاعلات الجزيئية بين الحمض النووي والجزيئات الواردة في مزيج التعبير.
المقدمة
الخلية الحرة التعبير الجيني ردود الفعل ذات أهمية كبيرة لمختلف التطبيقات في الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية. وكان التعبير الخلية خالية من البروتينات مفيدة لإعداد عينات البروتين النقي، التي كانت الأساس للعديد من الدراسات في علم الأحياء الهيكلية. على سبيل المثال، نظم خالية من الخلية بنجاح واستخدمت للتعبير عن البروتين المجمعات1 أو غشاء بروتينات2، التي يصعب أن تنتج باستخدام تعبير يستند إلى الخلية. جدير بالذكر أن الخلية خالية من التعبير الجيني ردود الفعل واستخدمت أيضا توضيح بنية الشفرة الجينية، بدءاً من التجارب الرائدة واسطة Nirenberg ومأتى في عام 19613.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يرد جدولاً زمنياً للخطوات المذكورة في الأقسام المختلفة في المعلومات التكميلية (القسم 1).
1-رقاقة تلفيق
ملاحظة: كركائز، استخدام رقائق السليكون (بقطر 100 ملم، والسماكة مم 0.525) مع طبقة سميكة 50 نانومتر من ثاني أكسيد السيليكون أو الشرائح الزجاجية (24 ملم × 24 مم، رقم 1، 5؛ 22 مم × 50 مم، رقم 4). اعتماداً على التطبيق، أحجام وسمك أخرى قد تكون أكثر ملاءمة.
- التنظيف ركائز عبر RCA تنظيف الداخلي (الماء ومحلول الأمونيا NH3(aq) 30% وفوق أكسيد الهيدروجين ح2س2 30%، بنسبة 5:1:1)
- مزيج الماء والأمونيا الحل في كوب كوب وتسخين المخلوط على 70 درجة مئوية على لوحة الس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الطباعة الحجرية خطوتين: يبين الشكل 5 نتيجة لعملية من خطوتين معدني على شريحة زجاجية مع تداخل أنماط من خيوط ديس المسمى فلوريسسينتلي.
التعبير بروتين فلوري من فرشاة جينات: الشكل 6 يوضح التعبير عن البروتين الفلورسنت يبيت من الحمض النووي المعطل تداولها. في نقاط عدة في الوقت قمنا بتقييم معدل التعبير الجيني جزئيا تبيض البروتين الفلورسنت ومراقبة استرداد إشارة الأسفار، متجاهلة ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطباعة الحجرية بيفر تقنية قوية وتنوعاً لتجميد منقوشة من الحمض النووي الريبي أو. حتى الآن، الإجراء الذي يتضمن العديد من الخطوات، التي-إذا تغيرت--يمكن أن تكون مصدرا للفشل أو تخفيض أداء النظام.
هو خطوة حاسمة في تصنيع رقائق بيفوري بيجيلاتيون الركازة، الذي يوفر في توافق مع الحياة السطح. هنا، خطوة التنظيف مع إجراء تقييم النتائج والكفاءات الهامة، حيث أنه ينشط أيضا على السطح سيلانيزيشن اللاحقة. يجب أن تجف الركيزة لا، في أثناء بيجيلاتيون الفعلي، في أن. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم تخزين سيلاني-شماعة-الب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونعترف مع الامتنان الدعم المالي لهذا المشروع "ستيفتونغ فولكس واجن" (منحة رقم 89 883) و "مجلس البحوث الأوروبي" (اتفاق منحة رقم 694410-عدنا). س. م. س. وتسلم الدعم المقدم من DFG من خلال GRK 2062.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| رقاقة السيليكون مع ثاني أكسيد السيليكون 50 نانومتر (ركيزة بيفور) سماكة | رقاقة | (& مايكرو; م): 525 & plusmn; 25 ، القطر (مم): 100 | |
| رقاقة السيليكون (لقالب PDMS الرئيسي) سمك | رقاقة | (& micro ؛ م): 525 & plusmn; 25 ، القطر (مم): 76.2 (3 بوصة) | |
| شرائح زجاجية رقم 4 | Menzel | 22 مم × 50 مم | |
| شرائح زجاجية رقم 1.5 | مساعد | 24 مم × 24 مم | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| التولوين اللامائي | سيجما ألدريتش (ميرك) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| تقنيات الحمض النووي المتكاملة ( IDT) | |||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR |
| kit Wizard SV Gel ونظام تنظيف PCR ؛ | Promega | A9281 | Spin-column PCR تنظيف |
| طقم PURExpress | نيو إنجلاند Biolabs | E6800S | نظام التعبير الخالي من الخلايا |
| PDMS | داو كورنينج | سليجارد 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE (المعرف: 0.8 مم ، OD: 1.6 مم) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist المطور | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | التصاق مروج السيليكون | |
| ثنائي المكون | Picodent | Twinsil | |
| احباط صفراء للحماية من الأشعة فوق البنفسجية | Lithoprotect (عبر MicroChemicals) | Y520E212 < | |
| قوي > المعدات < / قوي > | |||
| أقنعة للطباعة الحجرية الضوئية | Zitzmann GmbH | 64.000 نقطة في البوصة ، 180 × 240 مم | |
| مجهر مستقيم | أوليمبوس | BX51 | التصوير الحجري الضوئي والتصوير الفلوري |
| 60x هدف الغمر في الماء | Olympus | LumPlanFl | مستخدم مع Olympus BX51 ، NA 0.9 |
| 20x هدف الغمر في الماء | Olympus | LumPlanFl | المستخدم مع Olympus BX51 ، NA 0.5 |
| Photometrics | Coolsnap HQ | المستخدم مع Olympus BX51 | |
| Ligtht مصدر | EXFO | X-Cite 120Q | المستخدم مع Olympus BX51 |
| المجهر المقلوب | Nikon | Ti2-E | Fluorescence تصوير التعبير الجيني |
| 4x موضوعي | نيكون | CFI P-Apo 4x Lambda | المستخدم مع كاميرا نيكون Ti2-E |
| Andor | Neo5.5 | المستخدم مع مصدر الضوء Nikon Ti2-E | |
| Lumencor | SOLA SM II | نيكون Ti2-E | |
| Okolab | الجريء | نيكون Ti2-E | |
| Elveflow | OB1 MK3 | ||
| النانو ضوئي | قياس تركيز الحمض | ||
| النووي منظف البلازما | داينر | فيمتو | 200 واط ، يعمل بسرعة 0.8 ملي بار مع العينة في قفص فاراداي |
المراجع
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
