本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。
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方法文章
人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
经典瞬时受体电位通道亚家族（TRPCs）属于非选择性阳离子通道，在钙稳态中发挥关键作用，特别是对维持突触囊泡释放和细胞内信号通路正常功能至关重要的库操作性钙内流过程。因此，TRPC通道已被证实与多种人类疾病相关，包括心脏肥厚等心血管疾病、帕金森病等神经退行性疾病以及脊髓小脑性共济失调等神经系统疾病。正因如此，TRPC通道被认为是治疗人类疾病的潜在药理学靶点。然而，这些通道的门控分子机制仍不明确。获取大量稳定、均一且纯化的蛋白一直是结构解析研究中的限制因素，尤其是对于TRPC离子通道这类哺乳动物膜蛋白而言。本文介绍了一种利用改良型杆状病毒基因转移系统进行哺乳动物离子通道膜蛋白大规模表达的实验方案，并通过亲和层析和尺寸排阻层析对这些蛋白进行纯化。此外，我们还提供了从纯化蛋白样品中采集单颗粒冷冻电子显微镜图像，并利用这些图像解析蛋白结构的实验流程。结构解析是深入理解离子通道门控行为与功能机制的有力手段。
引言
钙参与了大多数细胞过程，包括信号级联、转录调控、神经递质释放以及激素分子的合成1,2,3。细胞质游离 钙的稳态维持对细胞的健康与功能至关重要。细胞内钙稳态的主要机制之一是库操纵性钙内流（SOCE），该过程是指内质网（ER）中储存的钙耗竭后，触发细胞膜上的离子通道开放，从而促进内质网钙的再充盈，以供后续信号传导使用4,5,6。瞬时受体电位通道（TRPCs）是一类属于TRP通道超家族的钙通透性通道，已被确认为SOCE中的主要参与者7,8,9。
在TRPC家族的七个成员中，TRPC3、TRPC6和TRPC7构成一个同源亚组，其独特之处在于可被脂质第二信使二酰甘油（DAG）激活，而DAG是信号脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）的降解产物10,
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方案
1. 转化DH10α感受态细胞以制备Bacmid DNA
- 合成目标基因，并将其亚克隆至一种改良版 pEG 载体中，该载体包含一个双链霉亲和素标签（twin strep-tag）、一个 His8 标签以及带有凝血酶切割位点的绿色荧光蛋白（GFP），位于 N 末端（pFastBacI）20。
- 取 5 ng 含有所需基因的 pFastBacI 质粒加入到 1.5 mL 离心管中的 50 μL DH10α 感受态细胞中，冰上孵育 10 分钟；随后在 42 °C 热激 45 秒；加入 200 μL 含分解抑制物的超优肉汤（SOC）培养基，于 37 °C、225 rpm 摇床中孵育 4–8 小时。
- 取 5 μL 菌液涂布于含 bacmid 的 LB 琼脂平板（含 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 妥布霉素、10 μg/mL 四环素、100 μg/mL Bluo-gal 和 40 μg/mL 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 [IPTG]）上。
- 将平板于 37 °C 培养 48 小时。
注意：Bluo-gal 指示剂可使仍表达 lacZ 的菌落显色（表明载体插入失败），从而便于筛选出白色菌落（转化成功）。 - 仔细挑选一个孤立的白色菌落，避免选择与蓝色菌落接触的白色菌落，将菌液接种于 6 mL bacmid LB 培养基（含 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 妥布霉素、....
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结果
人TRPC3蛋白表达与纯化方案的示意图见图1A。显示了含有理想白色菌落的人TRPC3 bacmid平板图像，该平板与用于bacmid DNA纯化的菌落选择相似，如图1B所示。我们发现，48小时是实现清晰Bluo-gal染色同时保持单菌落分离的最佳时间。在Sf9昆虫细胞中感染4天后，通过GFP荧光观察到hTRPC3的P2病毒产量达到峰值（图1C）。
P2 baulovirus 从培养基中收获后，添加 1% FBS，并用于感染 HEK293 哺乳动物细胞悬液。病毒感染后 12–18 小时，向细胞中加入丁酸钠以增强蛋白表达20。随后，细胞在 30 °C 下继续孵育 36 小时。收集细胞，并通过荧光偶联 SEC（FSEC）进行溶解度和稳.......
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讨论
近年来，得益于新型相机和算法的发展，冷冻电镜（cryo-EM）在蛋白质结构解析方面彻底改变了结构生物学领域，显著加快了难以结晶的蛋白质（尤其是膜蛋白）的结构解析进程。尽管冷冻电镜技术取得了诸多最新进展，但制备出足够质量和数量的高纯度蛋白质以支持高质量成像，往往仍耗时、昂贵且具有挑战性。如上述方案所述，能够在多种纯化条件下快速表达并筛选多个基因构建体的能力，提高了这一过程的效率，使得高质量纯化蛋白质的快速、低成本生产成为可能，从而可用于冷冻电镜研究。
尽管本文所述方法在成本上低于直接转染、在时间上快于构建稳定转染细胞系，从而实现大量纯化哺乳动物膜蛋白的目的，但该方法包含多个步骤，每个步骤均需优化以获得高质量的蛋白产量。在hTRPC3蛋白的表达与纯化所涉及的生化技术中，存在若干关键步骤和检查点。第一个关键检查点是杆状病毒DNA（bacmid DNA）的制备。如结果部分所述，理想的菌落筛选是获得高质量病毒用于蛋白表达的第一步。此外，若从所选菌落中提取的bacmid DNA浓度低于1 μg/μL，则所得病毒将不足以支持高效的蛋白表达。第二个关键检查点是P1和P2代杆状病毒的制备。病毒滴度可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢G. Zhao和X. Meng在David Van Andel高级冷冻电子显微镜平台进行数据收集时提供的支持。感谢VARI高性能计算团队在计算方面提供的支持。我们衷心感谢N. Clemente、D. Dues、J. Floramo、Y. Huang、Y. Kim、C. Mueller、B. Roth和Z. Ruan对本手稿提出的宝贵意见，这些意见极大地改进了本文。我们感谢D. Nadziejka为本手稿提供的编辑支持。本工作由VARI内部经费资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pEG BacMam 载体 (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α 细胞 | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. 培养基 | Corning | 46003CR | 用于 DH10α 细胞的 Bacmid 转化 |
| Bacmam 培养平板 | Teknova | L5919 | 用于转化后 DH10α 细胞的培养 |
| 细菌培养用摇床 | Infors HT | Multitron standard | |
| 昆虫细胞用轨道摇床 | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| 哺乳动物细胞用 CO2 培养箱 | Thermo-Fisher | 3951 | |
| 台式轨道摇床 | Thermo-Fisher | SHKE416HP | 用于哺乳动物细胞 CO2 培养箱内 |
| 培养箱 | VWR | 1535 | 用于细菌平板培养 |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27106 | 用于质粒提取与纯化 |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 | Invitrogen | 15593031 | 用于 DNA 提取 |
| Sf9 细胞 | Life Technologies | 12659017 | 用于病毒生产的昆虫细胞 |
| Sf-900 培养基 | Gibco | 12658-027 | 昆虫细胞培养基 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | 用于昆虫细胞转染 |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 用于哺乳动物细胞转染 |
| 0.2 mm 注射器滤器 | VWR | 28145-501 | 用于过滤 P1 病毒 |
| 0.2 mm 滤膜瓶（500 ml 储液瓶） | Corning | 430758 | 用于过滤 P2 病毒 |
| 锥形培养瓶（平底 2L） | Gene Mate | F-5909-2000 | 用于昆虫细胞培养 |
| 锥形培养瓶（带挡板 2L） | Gene Mate | F-5909-2000B | 用于哺乳动物细胞培养 |
| nanodrop 2000 分光光度计 | Thermo-Fisher | ND-2000 | 用于测定 DNA 和蛋白质浓度 |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | 用于蛋白质表达的哺乳动物细胞 |
| Freestyle 293 表达培养基 | Gibco | 1238-018 | 用于蛋白质表达的哺乳动物细胞培养基 |
| 丁酸钠 | Acros | 263195000 | 用于增强蛋白质表达 |
| PMSF | Acros | 215740500 | 蛋白酶抑制剂 |
| 牛肺来源抑肽酶 | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | 蛋白酶抑制剂 |
| 亮抑蛋白酶肽盐酸盐 | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | 蛋白酶抑制剂 |
| 胃蛋白酶抑制剂 A | Fisher Scientific | BP2671-250 | 蛋白酶抑制剂 |
| 皂苷 | EMD Millipore | 300410 | 去垢剂 — 用于从膜中溶解蛋白质 |
| 咪唑 | Sigma | 792527 | 用于从树脂柱中洗脱蛋白质 |
| TALON 树脂 | Clonetech | 635504 | 用于 His 标签亲和纯化 |
| superose6 increase 柱 | GE | 29091596; 29091597 | 用于 HPLC 和 FPLC |
| Prominence 模块化 HPLC 系统 | Shimadzu | 见下文 | |
| 控制器模块 | " | CBM20A | |
| 溶剂输送系统 | " | LC30AD | |
| 荧光检测器 | " | RF20AXS | |
| 带冷却功能的自动进样器 | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC 系统（含组分收集器） | Akta | ||
| 凝血酶（α） | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | 用于切割 GFP 标签 |
| Amicon Ultra 15 mL 100K 离心滤管 | Millipore | UFC910008 | 用于浓缩蛋白质 |
| EDTA | Fisher | E478500 | 用于稳定蛋白质 |
| 400 目碳膜铜网 | Ted Pella Inc. | 01754-F | 负染用载网 |
| Quantifoil 载金载网（金，1.2/1.3 μm 孔径/孔间距，300 目） | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | 冷冻电镜用载网 |
| Vitrobot Mark III | FEI | 用于通过液态乙烷冷冻制备样品载网 | |
| 液氮 | Dura-Cyl | UN1977 | |
| 乙烷气体 | Airgas | UN1035 | |
| Solarus 等离子体系统 | Gatan | Model 950 | 用于样品冷冻前的载网清洁 |
| Tecnai Spirit 电子显微镜 | FEI | 用于负染电镜成像 | |
| Talos Arctica 电子显微镜 | FEI | 用于冷冻电镜载网的筛选和低分辨率成像 | |
| Titan Krios 电子显微镜 | FEI | 用于高分辨率冷冻电镜成像 | |
| 软件 | |||
| Gautomatch 软件 | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | 用于从显微图像中挑选颗粒 | |
| Relion 2.1 软件 | https://github.com/3dem/relion | 用于构建二维和三维分类 | |
| CryoSPARC 软件 | https://cryosparc.com/ | 用于生成初始结构模型 | |
| Frealign 软件 | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | 用于颗粒精细化 | |
| Coot 软件 | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | 用于构建模型 | |
| MolProbity 软件 | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | 用于评估原子模型的几何结构 | |
| SerialEM 软件 | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | 用于自动化连续图像堆栈采集 | |
| MotionCor2 软件 | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | 用于对累加电影堆栈进行运动校正 | |
| GCTF 软件 | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | 用于测量电影堆栈中的离焦值 | |
| Phenix.real_space_refine 软件 | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | 用于对初始三维模型进行实空间精细化 |
参考文献
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone se....
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重印与许可
