Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Bernd Zobiak; Antonio Virgilio Failla

doi:10.3791/58756

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Article de méthode

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

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DOI :

10.3791/58756

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21 janvier 2019

Bernd Zobiak¹ , Antonio Virgilio Failla¹

¹UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Dans cet article

Résumé

Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu'à 3,5 s par la pile de l’image.

Résumé

Dans les cellules vivantes, les processus tels que la formation d’adhérences impliquent des changements structurels importants dans la membrane plasmique et l’intérieur de la cellule. Afin de visualiser ces événements très dynamiques, on a combiné les deux techniques de microscopie optique complémentaire permettant l’imagerie rapide des échantillons vivants : filature de la microscopie (SD) de disque pour l’enregistrement de volume rapide et haute résolution et de la réflexion totale interne microscopie de fluorescence (FRBR) pour la localisation précise et visualisation de la membrane plasmique. Un protocole d’imagerie complète et s’affichera pour les guider dans la préparation de l’échantillon, l’étalonnage de microscope, formation d’images et acquisition, résultant en une série d’imagerie live avec haute résolution spatio-temporelle du SD-FRBR multicolore. Toutes les étapes de post-traitement image nécessaire pour générer multidimensionnelle datasets imagerie direct, c'est-à-dire l’enregistrement et la combinaison des canaux individuels, sont fournis dans une macro autonome écrite pour le logiciel open source ImageJ. L’imagerie des protéines fluorescentes au cours de l’initiation et la maturation des complexes de l’adhérence, ainsi que la formation du réseau d’actine du cytosquelette, a été utilisé comme une preuve de principe pour cette approche originale. La combinaison de la microscopie 3D de haute résolution et de la FRBR a fourni une description détaillée de ces processus complexes dans l’environnement cellulaire et, en même temps, une localisation précise des molécules associées aux membranes détecté avec une haute rapport de signal-à-fond.

Introduction

Nos jours, les techniques de microscopie optique fournissant l’imagerie haute/super résolution en fixe et spécimen vivant sont développent rapidement. Techniques de super-résolution telles que stimulent d’émission microscopie d’illumination épuisement (STED), structuré (SIM) et la microscopie de photoactivation localisation (PALM) ou microscopie directes de reconstruction stochastique optique (STORM), respectivement, sont disponible dans le commerce et permettent l’imagerie des structures subcellulaires, montrant des détails presque à l’échelle moléculaire¹^,²^,³^,