Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Yukitomo Arao; Kenneth S. Korach

doi:10.3791/58758

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Articolo metodologico

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

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DOI:

10.3791/58758

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19 dicembre 2018

Yukitomo Arao¹ , Kenneth S. Korach¹

¹Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

Abstract

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza della proteina ERα è altamente conservata tra le specie. Si è pensato che la funzione dell'essere umano e il mouse ERαs è identico. Dimostriamo l'effetto differenziale 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) il mouse e attività dimerizzazione del dominio (LBD) del ligand-legantesi ERα umana usando l'analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi. Il dosaggio di M2H in grado di dimostrare l'efficienza delle attività di omodimerizzazione LBD in cellule di mammifero, che utilizzano la transfezione di due plasmidi di espressione della proteina (GAL4 DNA-binding dominio [DBD] fusione LBD e VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusione LBD) e un Elemento Gal4-sensible a reagire (GAL4RE) fuso plasmide del reporter di luciferase. Quando la fusione GAL4DBD LBD e la fusione di VP16AD LBD fanno un dimero nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva un'espressione di gene della luciferasi attraverso l'attività di trascrizione dipendente VP16AD. L'attivazione di 4OHT-mediata luciferasi è maggiore nelle cellule HepG2 che sono state trasfettate con i plasmidi della espressione di proteina fusione ERα LBD di mouse rispetto nelle cellule del plasmide transfettata espressione umane del proteina fusione ERα LBD. Questo risultato suggerisce che l'efficacia del mouse 4OHT-dipendente attività omodimerizzazione ERα LBD è superiore umano ERα LBD. In generale, l'utilizzo del dosaggio M2H non è ideale per la valutazione dell'attività di dimerizzazione LBD recettore nucleare, perché agonistiche ligandi che permettono di migliorare il livello basale dell'attività LBD e che impedisce la rilevazione di attività di dimerizzazione LBD. Abbiamo trovato che 4OHT non migliora l'attività basale ERα LBD. Che è un fattore chiave per essere in grado di determinare e rilevare l'attività di dimerizzazione di LBD 4OHT-dipendente per con successo usando l'analisi M2H. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare l'attività agonista parziale dei modulatori del recettore estrogeno selettivo (ad esempio, 4OHT) in vari tipi di cellule di mammifero.

Introduzione

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza dell'amminoacido ERα è altamente conservata tra le specie. A causa di più alta omologia tra umani ed ERα il mouse, la funzione di questi recettori è pensata come identici, e l'attività differenziale di sostanze estrogeniche (ad es., tamoxifene) in quelle specie è causato da differenze della specie in metabolismi chimici piuttosto che dalle differenze strutturali di ERα. ERα è altamente conservata strutture di dominio che sono comuni tra la superfamiglia dei recettori nucleari (NR), designato ai domini di F. E dominio o dominio di legame al ligando....