Detectar la actividad de dimerización de dominio Ligand-obligatorio del Receptor de estrógenos alfa usando el análisis de dos híbridos mamífero

Resumen

Se presenta un método para el análisis de la 4-hidroxi-tamoxifeno-dependiente de estrógeno actividad del receptor alfa-ligando dominio dimerización usando el ensayo de híbridos de dos mamífero.

Resumen

Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. La secuencia de la proteína ERα es altamente conservada entre especies. Se ha pensado que la función del ser humano y el ratón ERαs es idéntico. Demostramos el efecto diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) en ratón y ERα ligand-atar dominio (LBD) dimerización actividad humana usando el análisis de (M2H) híbrido de dos mamífero. El ensayo de M2H puede demostrar la eficacia de la actividad de T329N LBD en células de mamíferos, mediante la transfección de plásmidos de expresión de dos proteínas (ADN GAL4 dominio [DBD] fusión LBD y VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusión LBD) y un Elemento GAL4-sensible (GAL4RE) fusionados con el plásmido reportero de luciferasa. Cuando la fusión de GAL4DBD LBD y la fusión de VP16AD DLB un dimer en las células, este complejo de la proteína se une a la GAL4RE y, luego, activa una expresión de gen de luciferasa a través de la actividad de transcripción dependiente de VP16AD. La activación mediada por 4OHT luciferase es mayor en las células HepG2 fueron transfectadas con el ratón ERα LBD fusión proteína expresión plásmidos que el ERα LBD fusión proteína expresión plásmido transfectada las células humanas. Este resultado sugiere que la eficacia del ratón 4OHT-dependiente de la actividad de T329N ERα LBD es superior a la humana ERα LBD. En general, la utilización del ensayo M2H no es ideal para la evaluación de la actividad de dimerización de receptores nucleares LBD, porque ligandos agonistas realzar el nivel basal de la actividad LBD e impide la detección de actividad de dimerización de LBD. Se encontró que 4OHT no mejorar la actividad basal de ERα LBD. Es un factor clave para poder determinar y detectar la actividad de dimerización de LBD dependiente de la 4OHT para usar con éxito el ensayo de M2H. M2H ensayos de ERα LBD pueden aplicarse para estudiar la actividad de agonista parcial de moduladores selectivos de estrógeno receptor (e.g., 4OHT) en varios tipos de células de mamífero.

Introducción

Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. El aminoácido sequenceof ERα es altamente conservada entre especies. Debido a la mayor homología entre humanos y ratón ERα, la función de estos receptores es considerada como idéntico, y la actividad diferencial de sustancias estrogénicas (p. ej., tamoxifeno) en las especies es causada por las diferencias de las especies de metabolismos químicos en lugar de por las diferencias estructurales de ERα. ERα altamente ha conservado las estructuras de dominio que son comunes entre la superfamilia de receptores nucleares (NR), señalada A que dominios de F. El dominio E....

Protocolo

1. preparación de plásmidos para el ensayo de híbridos de dos mamífero

1. Utilice el siguiente plásmidos: pG5-Luc, pBIND-ERαEF y ERαEF Pacto.
   Nota: La plásmidos son de los autores a petición y se envían en papel de filtro. pG5-Luc es el plásmido reportero que contiene cinco repeticiones de GAL4 sensibles elementos fusionados con la unidad de expresión de luciferasa (figura 1A). pBIND-ERαEF es el plásmido de expresión de proteína las proteínas fusionados con GAL4DBD ERα LBD. pBIND ERαEF contiene una unidad de expresión de luciferasa Renilla para normalizar la eficiencia de transfección (figur....

Resultados

Figura 3 muestra el esquema de posibles respuestas en la combinación (i) y combinación (ii) plásmido transfected células. Los resultados experimentales se muestran en la figura 4. La actividad de combinación (i) (pG5-Luc + pBIND mERαEF Pacto) muestra estímulo de 10 nM E2 (figura 4A), porque el ERα LBD contiene el dominio funcional del transactivation dependiente de ligando, AF-2. Ago.......

Discusión

Adjunto, describimos el protocolo para el ensayo de M2H, centrándose en las condiciones de ensayo para la detección de la actividad de T329N de ERα LBD como ejemplo. En general, el ensayo M2H no es popular para la evaluación de la actividad de dimerización ligand-dependiente ERα LBD. Esto es debido a la LBD ERα poseen una función de activación transcripcional; la actividad que molesta, en algunos casos, los resultados del ensayo M2H. Sin embargo, como se demuestra aquí, el ensayo M2H puede ser usado para el análisis de l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pG5-Luc	Promega	E249A	Componente del sistema CheckMate Mammalian Two-Hybrid
pBIND	Promega	E245A	Componente del sistema CheckMate Mammalian Two-Hybrid
pACT	Promega	E246A	Componente del CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Químicamente Competente E. coli	Invitrogen C404010
Rotor centrífugo	SORVALL	75006445
Cucharas oscilantes	SORVALL
(CRA)	Promega	A7112
Solución de lisis celular (CLA)	Promega	A7122
Solución de neutralización (NSA)	Promega	A7131
Solución de lavado de columna (CWB)	Promega	A8102
Wizard Midipreps Resina de purificación de ADN	Promega	A7701
Wizard Midicolumns	Promega	A7651
MEM, sin glutamina, sin rojo fenol	Gibco	51200038
L-glutamina (200 mM)	Gibco A2916801
0,5% Tripsina-EDTA (10x)	Gibco	15400054
Penicilina-estreptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	P0781
BenchMark suero fetal bovino (FBS)	Gemini-Bio	100-106	Carbón inactivado por calor
: suero fetal bovino que se desprende con dextrano	Gemini-Bio	100-119	DMEM inactivado por calor
, alto en glucosa, sin glutamina, sin fenol rojo	Gibco	31053028	para la transfección
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027
Lisis pasiva 5X Tampón	Promega	E1941
Sistema de ensayo reportero de luciferasa dual	Promega	E1980
SpectraMax L Lector de microplacas	Molecular Devices
SoftMax Pro Software	Molecular Devices

Solución de resuspensión de celdas 75006441