وكثيراً ما تمارس البروتينات المرتبطة هيكلياً الوظائف البيولوجية المتميزة. تبادل مناطق ما يعادل هذه البروتينات من أجل خلق البروتينات تشيميريك يشكل نهجاً مبتكراً لتحديد المناطق الحرجة البروتين التي المسؤولة عن الاختلاف الوظيفي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد المناطق الوظيفية البروتين من خلال تشييد البروتين تشيميريك
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والهدف من هذا البروتوكول يشمل تصميم البروتينات تشيميريك فيها مناطق متميزة من البروتين تحل محلها تسلسل المقابلة في بروتين هيكلياً مشابهة، من أجل تحديد أهمية هذه المناطق الوظيفية. مثل هذه التركيبات يتم إنشاؤها بواسطة بروتوكول PCR متداخلة باستخدام شظايا من الحمض النووي متداخلة والمصممة على نحو كاف الإشعال، متبوعاً بالتعبير عنها ضمن نظام الثدييات لضمان هيكل الثانوية الأصلية والتعديلات بوستترانسلاشونال.
ثم يشار إلى الدور الوظيفي لمنطقة متميزة بفقدان نشاط الوهم في مقايسة قراءات مناسبة. ونتيجة لذلك، يتم تحديد مناطق إيواء مجموعة من الأحماض الأمينية الهامة، التي يمكن أن تكون كذلك فرزهم بتقنيات تكميلية (مثل موقع الموجه الطفرات) لزيادة دقة الجزيئية. على الرغم من أن يقتصر على الحالات التي يمكن العثور على بروتين هيكلياً المتصلة بوظائف مختلفة، البروتينات تشيميريك قد استخدمت بنجاح لتحديد المناطق الحرجة ملزمة في البروتينات مثل السيتوكينات وسيتوكين المستقبلات. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة في الحالات التي لا تكون المناطق الوظيفية للبروتين محددة تحديداً جيدا، ويشكل خطوة أولى قيمة في نهج التطور الموجه لتضييق المناطق ذات الاهتمام وتقليل الجهد الفحص المعنية.
المقدمة
يتم تجميع عدة أنواع من البروتينات، بما في ذلك السيتوكينات وعوامل النمو، في أسر أعضاؤها مشاركة هياكل ثلاثية الأبعاد مشابهة ولكن غالباً ما يمارس الوظائف البيولوجية المتميزة1،2. هذا التنوع الوظيفي هو عادة نتيجة للفروق الصغيرة في تكوين الأحماض الأمينية داخل المواقع النشطة للجزيء3. تحديد هذه المواقع والمحددات الوظيفية لا فقط تقدم أفكاراً قيمة تطورية بل أيضا لتصميم أكثر تحديداً يضع ومثبطات4. ومع ذلك، عدد كبير من الاختلافات في تكوين بقايا كثيرا ما وجدت بين البروتينات المرتبطة هيكلياً تعقيد هذه المهمة. على الرغم من أن تشييد المكتبات الكبيرة التي تحتوي على مئات طفرات في ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تصميم البروتين تشيميريك
- تحديد بروتين مناسب (المانحين) لتبادل مناطق مع البروتين للفائدة (المتلقي) ينبغي أن يكون البروتين المانحين هيكلياً مشابهة، من الناحية المثالية الذين ينتمون إلى نفس الأسرة البروتين، ولكن تفتقر إلى النشاط البيولوجي لاستخدامها كقراءات. إذا تعرف لا البروتينات المرتبطة هيكلياً، يمكن تحديد المرشحين المحتملين باستخدام أداة مؤتمتة مثل ال14،أداة البحث المحاذاة المتجهات (واسعة)15
- الوصول إلى مصرف بيانات البروتين (PDB)16 موقع الأوروبية (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/) وإدخال اسم بروتين الفائدة في مربع البحث في الزاوية العلوية اليمنى، وانقر فوق 'بحث'. شريطة أن ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وسوف تجسد البناء وتوليد بروتين تشيميريك (الشكل 1) مع اثنين من أعضاء الأسرة سيتوكين انترلوكين-6، OSM وليف، والتي كانت موضوع دراسة نشرت مؤخرا6. ويبين الشكل 2 هيكل ثلاثي الأبعاد لهذه البروتينات. كلا جزيئات اعتماد هيكل الثانوية المميزة لفئة أنا السيتوكينات، مع أربعة لوالب (يطلق عليه أ إلى د) معبأة في حزمة، وانضم إليها الحلقات28. هياكل الانحياز من الأحماض الأمينية البروتينات البشرية يتبي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويشكل توليد بروتينات تشيميريك تقنية متعددة الاستعمالات، وقادرة على تجاوز حدود البروتينات مبتوراً بمعالجة مسائل مثل الجزئية سيتوكين-مستقبلات ملزم المجالات13. تصميم التركيبات هو خطوة أساسية في هذا النوع من الدراسات، ويتطلب دراسة متأنية. الدراسات الأولية إنشاء مجالات وظيفية عموما سيتطلب الاستعاضة عن مناطق واسعة في مرحلة أولى، بينما البدلاء أصغر من الأطوال المتغيرة أكثر ملاءمة لدراسات تفصيلية لمنطقة واحدة. ينبغي إيلاء اهتمام خاص لوجود زخارف المصانة الصغيرة داخل أسرة بروتين في هذه الخطوة، إذ كثيرا ما ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
أيد هذا العمل جمعية ماكس بلانك، و Schüchtermann-العيادة (روثينفيلدي سيئة، ألمانيا). وكان نشر جزء من هذه البحوث في "مجلة الكيمياء البيولوجية". أدريان-سيغارا، ج. م. شندلر، نون، جاجودا، ص، Lörchner، حاء، براون، ت. & Pöling، ج. حلقة AB ود-الحلزون في ربط الموقع الثالث من م Oncostatin البشرية (OSM) مطلوبة من أجل تنشيط مستقبلات OSM. ج. محاضرة الكيمياء عام 2018؛ 18:7017-7029. © المؤلفين.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | يمكن استخدام أي آلة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية لتنفيذ هذا البروتوكول |
| NanoDrop 2000c UV-Vis مقياس الطيف الضوئي | ThermoFisher Scientific | ND-2000C & nbsp ؛ | قياس الحمض النووي |
| سلم الحمض النووي GeneRuler 100 نقطة أساس | سلم الحمض النووي ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler سلم مزيج | سلم الحمض النووي ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| إنزيم تقييد AscI | نيو إنجلاند بيولابيس | R0558 | |
| إنزيم تقييد PacI | نيو إنجلاند بيولوجيز | R0547 | |
| فوسيون هوت ستارت II بوليميراز الحمض النووي | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| مجموعة dNTP (100 ملم) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel ومجموعة تنظيف PCR | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Sequence-Verified (CloneId: 7939578) ، مخزون الجلسرين | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| الاشعال | Sigma-Aldrich | طلب مخصص | |
| الإنسان Oncostatin M cDNA | هدية للدكتور هايكه هيرمانز (قسم أمراض الكبد ، المستشفى الجامعي W & uuml; rzburg, Germany) | ||
| متجه pCAGGS مع مواقع | هدية الدكتور أندر & eacute; شنايدر (معهد ماكس بلانك لأبحاث القلب والرئة ، باد نوهايم ، ألمانيا) |
المراجع
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
