Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.
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Artigo de método
Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células T utilizam diferentes programas metabólicos para combinar com suas necessidades funcionais durante a proliferação e diferenciação. As mitocôndrias são componentes celulares cruciais responsáveis pelo fornecimento de energia da célula; no entanto, as mitocôndrias em excesso também produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem causar morte celular. Portanto, o número de mitocôndrias constantemente deve ser ajustado para atender às necessidades das células. Este regulamento dinâmico é alcançado em parte através da função de lisossomos que removem macromoléculas e organelas excedente/danificado. Portanto, o conteúdo mitocondrial e dos lisossomos celular é indicadores-chave para avaliar a adaptação metabólica das células. Com o desenvolvimento de sondas para organelas, bem caracterizada lisossoma ou corantes específicos de mitocôndrias tornaram-se disponíveis em vários formatos para rotular as mitocôndrias e lisossomos celulares. Citometria de fluxo multicolor é uma ferramenta comum de fenótipos de célula de perfil e tem a capacidade de ser integrado com outros ensaios. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como combinar os corantes específicos organela com marcadores de superfície coloração para medir a quantidade de lisossomos e mitocôndrias em populações diferentes de células T em um citômetro de fluxo.
Introdução
A ativação e proliferação de células T são passos críticos para a montagem de sucesso respostas imunes. Avanços recentes sugerem que o metabolismo celular é fortemente associado com o desenvolvimento e as funções das células T. Por exemplo, ingênuo T células dependem em grande parte a fosforilação oxidativa (OXPHOS) para atender a demanda de energia durante a recirculação entre os órgãos linfoides secundários. Após a ativação, ingênuo T células passam por drásticas reprogramação metabólica, incluindo a indução da glicólise aeróbica para aumentar a produção de ATP e para atender as demandas metabólicas tremenda durante a proliferação e diferenciação celular. As células....
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Protocolo
O procedimento de colheita de tecidos rato descrito aqui foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade Nacional de Yang-Ming e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da suspensão de linfócitos de órgãos linfoides
- Eutanásia o mouse por um método aprovado como inalação de CO2 em uma câmara de acrílico transparente, seguida por deslocamento cervical para garantir a morte.
Nota: Manter a taxa de fluxo de CO2 para um deslocamento de 20% por minuto da câmara e não superior a 5 libras por polegada quadrada (libra por polegada quadrada). Demora 2-3 min para um mouse para perder a consciência. Manter....
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Resultados
Identificação dos principais células T subconjuntos no baço e Timo
Em breve, suspensões de célula única do baço e Timo foram lysed das células vermelhas do sangue, incubadas com sobrenadante 2.4G2, seguidas por organela específica tintura e marcador de superfície a coloração com anticorpos conjugados de fluorescência (tabela 1). A progressão do desenvolvimento de timócitos pode ser descrita usan.......
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Discussão
Este protocolo combina corantes específicos organela e marcador de superfície coloração para quantificar a quantidade de mitocôndrias ou lisossomos em populações diferentes de células T. Este método foi desenvolvido para superar a limitação da cela número e homogeneidade requisitos para os métodos tradicionais, tais como a microscopia eletrônica e análise de immunoblot. É especialmente útil na análise de populações de células raras e examinando simultaneamente vários tipos de células ao mesmo tempo.
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesses.
Agradecimentos
O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado por concessões do Taiwan Ministério da ciência e tecnologia (a maioria) NSC103-2320-B-010-002-MY2 e MOST104-2628-B-010-002-MY4 de C.L. Hsu. C.W. Wei é um receptor de excelente tese prêmio do Instituto de Microbiologia e Imunologia, Universidade Nacional de Yang-Ming.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pinça Graefe de 10 cm (reta e serrilhada) | Dimeda | ||
| de 11 cm (reta com cabeças afiadas/afiadas) | Dimeda | ||
| de 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| TERUMO | |||
| Placa de Petri de 6 cm | &alfa;-plus | ||
| 70 µ m filtro de células de nylon | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Cloreto de amônio (NH4Cl) | Clone de 102007 Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | PC61 | |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone: GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone: IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone: MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Tubo de fundo redondo de poliestireno (tubo FACS) | BD Biosciences | 352052 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hidroxietil piperazinaetanossulfônico (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamina (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Aminoácidos não essenciais (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Bicarbonato de potássio (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Solução de iodeto de propídio | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 meio (pó) | Gibco | 31800089 | |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Piruvato de sódio (100 mM) | Gibco | 11360070 |
Referências
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: i....
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Reimpressões e permissões
