我々は、ルシファーイエロー(LY)がヒト血液脳関門のインビトロモデルであるhCMEC/D3細胞単層の明らかな細胞透過性を決定する堅牢なマーカーであることを実証するために蛍光アッセイを提示する。このアッセイを用いて、培養hCMEC/D3細胞におけるコンフルエント単層形成の動態を決定した。
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この記事について
サマリー
要約
血液脳関門BBBは、全身循環と脳の間の障壁を形成する内皮細胞からなる非必須イオンと有毒物質の交換を防ぐ。タイトジャンクション(TJ)は、単層の準細胞空間を効果的にシールし、そのままのバリアを生み出します。本研究では、LYベースの蛍光アッセイを用いて、その明らかな透過性係数(Pアプリ)を決定し、次にコンフルエント単層の形成と得られたタイトジャンクションの動態を決定するために使用することができる。hCMEC/D3単層におけるバリアの完全性。我々はさらに、トランスフェクト細胞におけるTJ機能完全性を決定するために、このアッセイの追加の有用性を実証する。LY Pアプリアッセイからの我々のデータは、トランスウェルセットアップで播種されたhCMEC/D3細胞が効果的にLY細胞輸送7日後培養を制限することを示しています。提示されたアッセイの付加的な有用性として、我々はまた、DNAナノ粒子トランスフェクションがhCMEC/D3単層におけるLY細胞細胞輸送を変化しないことを実証する。
概要
血液脳関門(BBB)は、脳組織への血漿成分の流入を制限する保護障壁であり、脳内皮細胞とペリサイトなどの支持細胞からなる。BBBの主な役割は、神経微小環境1、2の血球を維持するために末梢血と中枢神経系(CNS)の間の空間を密封する障壁として機能する。脳毛細血管内皮細胞は、細胞間タイトジャンクション(TJs)1の形成を介して細胞間経路を効果的にシールする。この保護バリアは、ブドウ糖と選択された栄養素が脳に入ることを可能にする一方で、イオン、有毒物質、薬物の大部分がこのタイトな障壁を通過するのを防ぎます。その保護的役割とは別に、BBBの自然なバリア機能は、CNSを標的とする薬物送達システムの開発において深刻な課題を提起する。
BBBのインビトロ細胞培養モデルは、その生物学を研究し、TJバリア完全性に対する薬物治療の影響を理解するのに役立つツールです。ヒト脳内皮細胞株(hCMEC/D3)をインビトロモデルとして用いたのは、ヒト脳内皮3の受け入れモデルであり、ヒトBBBの多くの機能を要約する。hCMEC/D3は、インビトロ4、5、6、7、8、9でBBBをモデリングするための最も一般的に使用される細胞株の一つです。
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プロトコル
1.一般的なhCMEC/D3細胞培養
- 凍結細胞の蘇生
注:すべての細胞培養維持および実験は無菌バイオセーフティフード内で行われた。培養培養剤、サプリメントおよび試薬は、無菌製品として購入するか、または微生物汚染を防止するために0.22 μm膜フィルターを用いて濾過を介して殺菌された。- 組織培養フラスコ(75cm2成長面積、今後はT75と呼ばれる)にコラーゲン溶液(0.15mg/mL)を8.5mL加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)に1時間置きます。
- コラーゲン溶液を取り出し、殺菌されたリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でフラスコを静かに洗います。フラスコに完全成長培地の15mLを加え、CO2インキュベーターに15分間放置します。
注:完全な培地(最終濃度)は、胎児ウシ血清(5%)、ペニシリン連鎖マイシン(1%)、ヒドロコルチゾン(1.4μM)、酸アスコルビン(5 μg/mL)、化学的に定義された脂質を補充した内皮細胞成長基底培地-2(500mL)を含有した。濃縮物(1/100)、HEPES(10mM)および基本的な線維芽細胞増殖因子(1 ng/mL)。 - 液体窒素タンクから凍結したhCMEC/D3細胞の凍結を移動し、37°Cの水浴(<1分)でバイアルを急速に解凍します。
- 氷の小さなフレークだけが見えたら、すぐに吸引し....
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結果
まず、TJ形成の明らかな運動性を決定するために、LY透過性に対する培養時間の効果を決定した。1 日目から 10 ポストシードまでの平均 LY Pアプリの値を図 2aに示します。1日目の平均Pアプリは4.25 x 10-4 cm/minで、2日目は3.32 x 10-4 cm/minにわずかに低下しました。平均Pアプリの値は3日目に3.93 x 10-4 cm/minにわずかに増加し、6日目まで有意な変化なしで変動しました。Pアプリの値は、おそらく1日目(P< 0.05)と比較して、7日目に2.36 x 10-4 cm/minに大幅に減少しました。Pアプリの値は、7日目から10日目までの2.14 x 10-4と2.36 x 10-4 cm/minの間の範囲で安定化し、バリ.......
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ディスカッション
BBBの重要な役割は、神経微小環境の無血症を維持するために、全身循環と脳との間の非必須イオンおよび有害物質の交換を防止することです。BBBの特徴の一つは、毛細血管内皮細胞が輸送の準細胞経路を効果的に密封するタイトジャンクション(TJ)を形成する能力である。培養hCMEC/D3単層におけるTJバリア形成の明らかな動態を決定する定量的方法としてのLY Pアプリアッセイを実証した。西洋ブロッティングを介して検出されたZO-1式は、次の段落で詳しく説明したように、LY Pアプリスタディからのデータを検証した。開発されたアッセイのさらなる有用性として、我々はさらに、DNA NPトランスフェクションが実験セットアップにおけるTJバリア特性の変化を決定するために、このアッセイの適合性を示すLY Pアプリを測定可能に変更しないことを実証した。
ウェスタンブロットデータは、3日目、5日目、7ポストシードにおけるZO-1発現の明らかな増加と10ポストシード(図4a)
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
著者らは、米国薬学会の2017年新研究者賞、デュケイン大学のハンケル恐れ病賞、マニッカム研究所の薬学部のスタートアップファンドからの財政的支援に感謝しています。私たちは、リーク研究所(デュケスネ大学)の西洋のブロッティング支援とオデッセイ16ビットイメージャーの使用を許可してくれたことに感謝します。また、カンダルプ・デイブ(マニッカム研究所)に対する感謝の気持ちを、西洋のブロッティングの助けを借りておきたい。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| hCMEC/D3細胞株 | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | ヒト脳微小血管内皮細胞株 |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNA |
| ルシファーイエローCHジリチウム塩 | ポリエチレン | ||
| オリンパスプラスチックス | 25-207 | ||
| 24ウェルフラットボトム | Olympus Plastics | 25-107 | |
| ブラック 96 ウェル イムノプレート | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | 内皮細胞基礎培地-2(EBM-2) |
| リン酸緩衝生理食塩水 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | ディスカバリー・ラボウェア株式会社 | ||
| Pierce BCAタンパク質アッセイキット | Thermo Scientific | 23227 | |
| 細胞培養溶解 5X 試薬 | プロメガ | E1531 | |
| ビートルルシフェリン、カリウム塩 | プロメガ | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | 蛍光プレートリーダー | |
| トリパンブルー溶液 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 ポリクローナル抗体 | ThermoFisher | 61-7300 | |
| 抗 GAPDH 抗体 | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680 標識 AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12 ウェル、平底 | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA バッファー (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | FisherBioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLxイメージャー | LI-COR | ウェスタンブロットメンブレンのスキャン用 |
参考文献
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
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