זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול המשלב במערכת התרבותית העצבית-אנדותל ושיתוף תרבות מטבולית והתאגדות המטבולית של sialoglycan עם קבוצות פונקציונליות bioorthogonal כדי להרחיב את גזע הגוף העצבי ואת התאים מחולל מותג התווית שלהם סיליגליקורופנס להדמיה או ניתוח המסה-ספקטרומטריה של סמני שטח התא.

Abstract

תאי גזע ומחולל שדים עצביים הם הבסיס התאי למבנים ולתפקודים המורכבים של המוח. הם ממוקמים נישות מיוחדות ב vivo והוא יכול להיות מבודד ומורחב בתוך מבחנה, משמש כמשאב חשוב עבור השתלת תאים כדי לתקן את הנזק המוחי. עם זאת, NSPCs הם הטרוגנית ולא מוגדר באופן ברור ברמה המולקולרית או מטוהרים בשל חוסר סמנים משטח תא ספציפי. הפרוטוקול המוצג, אשר דווח בעבר, משלבת מערכת משותפת עצבית-שיתוף התרבות עם שיטת התיוג המטבולית, כדי לזהות את המשטח הפנימי של NSPCs הראשי. מערכת התרבות שיתוף הפעולה NSPC-אנדותל מאפשרת חידוש עצמי והתרחבות של NSPCs הראשי בתוך מבחנה, הפקת מספר מספיק של nspcs. סיאלוגליקנים בתרבית nspcs מסומנים באמצעות כתבת מטבולית בלתי טבעית של חומצה סילית עם קבוצות פונקציונליות ביואורתוגונאליות. על ידי השוואת שיתוף הפעולה העצמי מחדש NSPCs התרחב בתרבות האנדותל עם תרבות עצבית מבדילים, אנו מזהים רשימה של חלבונים ממברנה כי הם מועשרים NSPCs. בפירוט, הפרוטוקול כולל: 1) הגדרת תרבות שיתוף NSPC-אנדותל ו-NSPC תרבות הבחנה; 2) תיוג עם אזידוסוכר לפי-או-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac₄mannaz); ו-3) ביוטין ליצירת שינויים בסיקלוגליל לדימות לאחר קיבוע של תרבות עצבית או חילוץ חלבונים מהתרבות העצבית לניתוח הספקטרומטר ההמוני. לאחר מכן, מועמדים לסמן משטח NSPC מועשר נבחרו על ידי ניתוח השוואתי של נתונים ספקטרומטר המוני משני NSPC המורחבת ותרבויות עצביות הבדיל. פרוטוקול זה רגיש מאוד לזיהוי חלבונים ממברנות של שפע נמוך בחומרי ההתחלה, והוא יכול להיות מיושם על גילוי סמן במערכות אחרות עם שינויים מתאימים

Introduction

תאי גזע עצביים מוגדרים כאוכלוסיית תאים רב-עוצמה אשר ניתן לחדש את עצמו כדי לשמור על תא גזע הבריכה להבדיל לנוירונים ו glia. הם סוגי התא העיקריים במערכת העצבים ועשויים להציע פוטנציאל תרפויטי גדול ברפואת ההתחדשות באמצעות השתלת תאים לתוך המוח החולני והפצוע^1,2. כמו התקדמות הפיתוח, האוכלוסיה הגזע העצבי הופך הטרודוגני^3,4, ואת החלק של תאי גזע עצביים במוח בהדרגה יורדת⁵. באופן כללי, תאים גזע עובריים ותאים אחרים העצביים הנוירוני, המכונה בצורה קולקטיבית בתאי גזע ומחולל קדמון (NSPCs), ממוקמים באזורים נבטי, אזור חדרית, ואת אזור subventricular ....

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים המשמשים במחקר זה אושרו על ידי IACUC (הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים) של אוניברסיטת Tsinghua והופיע בהתאם להנחיות של IACUC. מתקן חיות המעבדה באוניברסיטת Tsinghua כבר מוכר על ידי AAALAC (האגודה להערכת והסמכה של מעבדה בעלי חיים הבינלאומי טיפול). עבור ההיערכות של עוברים, באמצע היום של התקע הנרתיק זוהה היה מחושב כיום עובריים 0.5 (E 0.5).

הערה: כל התאים הם מתורבתים בחממה תא בתנאים של 37 ° c ו 5% CO₂.

1. הכנת תרבות אנדותל של העכבר בתוספות תמיכה

הערה: BEND3 תאים נשמרים על פי הוראות היצרן.

1. הכנת BEND3 cell בינונית ....

Results

ההליך כולו להרחבת מבחנה ותיוג מטבולית של NSPCs העובריים הראשי לוקח 6 ימים (איור 1A). איכות של קו התא BEND3 ו NSPCs הראשי המבודד הטרי הם המפתח לניסוי מוצלח. תאים BEND3 הם המקור של גורמים מסיסים המעוררים חידוש עצמי והתפשטות NSPCs. יש להבטיח כי התאים BEND3 חופשיים של כל זיהום ולחלק באופן פעיל עם מוות תאים מינימלי לפני co-culturing עם תאים עצביים. NSPCs העיקרי חייב להיות מוכן בקפידה כדי למנוע נזק עודף במהלך הדיסוציאציה. NSPCs פגום עשוי עדיין לגדול ולהבדיל; עם זאת.......

Discussion

סמני פני השטח משמשים בדרך כלל לתוויות ולטיהור סוגי תאים ספציפיים במבחנה ובvivo^17,18. גילוי של סמנים פני השטח תורם מאוד לרפואה משובי ומחקרים תא גזע על ידי מתן כלים מולקולריים באופן סלקטיבי להעשיר את האוכלוסייה תא גזע מרקמות נורמלי או פתולוגי מנות תרבות, מציע תא מטוהר משאב לשימוש קליני או למחקר של תכונות ביולוגיות. עם זאת, התקדמות בפיתוח סמנים פני השטח עבור מחקר תאי גזע עצביים כבר איטי בשל הקושי בבידוד תאי גזע מרקמות ראשיות. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס. על פלטפורמת .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-גלוטמין	Gibco	25030081	1%
נתרן פירובט	Sigma	P5280	1%
N2 תוסף	Gibco	17502048	1 עד 100
N-אצטיל-L-ציסטאין	Sigma	A7250	1 מ"מ
פפאין	וורת'ינגטון	LS003726	10 יח'/מ"ל
תוסף B27	Gibco		17504044 1 עד 50
פולי-L-ליזין	סיגמא	P4707
גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים	Gibco	PHG0261	10 ננוגרם/מ"ל
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140122	1%
סרום בקר עוברי	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
מאגר RIPA	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE מאגר טעינה 2x	Solarbio	P1018
צלחת 6 בארות	קורנינג	3335
ג'ל חלבון Tris-Glycine	invitrogen	xp00100box
עכבר חד שבטי אנטי-נסטין	מחקר התפתחותי בנק היברידומה	עכברוש-401	1 עד 20
עכבר חד שבטי אנטי-בטא-טובולין III	סיגמה	T8860	1 עד 1,000
אלקסה פלואור 488 עז נגד עכבר IgG1	invitrogen	A-21121	1 עד 1,000
אלקסה פלואור 546 עז נגד עכבר IgG2b	invitrogen	A-21143	1 עד 1,000
אלבומין בקר V	אמרסקו	0332
טריטון X-100	אמרסקו	0694
BCA ערכת בדיקה	Thermo Scientific	23225
דימתיל סולפוקסיד	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	קליק כימיה כלים	1084	100 ומיקרו; M
9AzSia	מסונתז במעבדה
נתרן אסקורבט	סיגמא	A4034
מתנול	סיגמא	34860
EDTA	סנגון	A100322
NaCl	סנגון	A100241
SDS	סנגון	A100227
קמח אלקסה 647 סטרפטווידין	מצומדinvitrogen	S21374	1 עד 1,000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
אמוניום ביקרבונט	סיגמא	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 ומיקרו; גרם/מ"ל
אוריאה	סיגמא	U5378