El propósito del método presentado aquí es mostrar cómo los microarrays de microambiente (MEMA) pueden ser fabricados y utilizados para interrogar el impacto de miles de microambientes combinatorios simples en el fenotipo de las células cultivadas.
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Artículo de método
Uso de microarrays para interrogar el impacto microambiental en fenotipos celulares en cáncer
En este artículo
Resumen
Resumen
Comprender el impacto del microambiente en el fenotipo de las células es un problema difícil debido a la compleja mezcla de factores de crecimiento solubles y proteínas asociadas a la matriz en el microambiente in vivo. Además, los reactivos fácilmente disponibles para el modelado de microambientes in vitro suelen utilizar mezclas complejas de proteínas que están incompletamente definidas y sufren de variabilidad lote a lote. La plataforma de microarray (MEMA) permite evaluar miles de combinaciones simples de proteínas de microambiente por su impacto en los fenotipos celulares en un solo ensayo. Los MEMA se preparan en placas de pozos, lo que permite la adición de ligandos individuales para separar los pocillos que contienen proteínas de matriz de matriz extracelular (ECM). La combinación del ligando soluble con cada ECM impreso forma una combinación única. Un ensayo MEMA típico contiene más de 2.500 microambientes combinatoriales únicos a los que las células están expuestas en un solo ensayo. Como caso de prueba, la línea celular de cáncer de mama MCF7 estaba chapada en la plataforma MEMA. El análisis de este ensayo identificó factores que mejoran e inhiben el crecimiento y la proliferación de estas células. La plataforma MEMA es altamente flexible y se puede ampliar para su uso con otras cuestiones biológicas más allá de la investigación del cáncer.
Introducción
El cultivo de líneas celulares cancerosas en plástico en monocapas bidimensionales (2D) sigue siendo uno de los principales caballos de batalla para los investigadores del cáncer. Sin embargo, el microambiente está siendo cada vez más reconocido por su capacidad para afectar a los fenotipos celulares. En el cáncer, se sabe que el microambiente tumoral influye en múltiples comportamientos celulares, incluyendo el crecimiento, la supervivencia, la invasión y la respuesta a la terapia1,2. Los cultivos celulares monocapa tradicionales suelen carecer de influencias en el microambiente, lo que ha llevado al desarrol....
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Protocolo
NOTA: En el diagrama de flujo que se muestra en la Figura 1se describe una descripción general de todo el proceso MEMA, incluido el tiempo estimado. Este protocolo detalla la fabricación de MEMAs en placas de 8 pocillos. El protocolo puede adaptarse a otras placas o portaobjetos.
1. Preparación de tampones de proteínas, diluyentes y tinción
- Equilibrar viales de EME, ligandos y citoquinas a temperatura ambiente (RT) y centrífuga brevemente. Agregue el volumen adecuado del búfer RT adecuado como se indica en la hoja de datos del producto. Siga las recomendaciones del fabricante para las....
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Resultados
Para simplificar los impactos microambientales en el crecimiento y la proliferación celular e identificar las condiciones que promovieron o inhibió el crecimiento celular y la proliferación, la línea celular de cáncer de mama MCF7 se sembraba en un conjunto de ocho MEMA de 8 pozos como se describe en el protocolo. Este ensayo expuso las células a 48 EME diferentes y 57 ligandos diferentes, para un total de 2736 condiciones microambientales combinatorias. Después de 71 h en cultivo, las células fueron pulsadas con EdU, fi.......
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Discusión
La importancia de la "dimensionalidad" y el contexto ha sido un factor motivador en el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro como herramientas en la caracterización de las células cancerosas a través de su interacción con el microambiente11,y la capacidad de in vitro sistemas de cultura para imitar el entorno in vivo es una fuerza impulsora detrás de la búsqueda de mejorar esos sistemas de cultivo. Los sistemas in vitro, sin embargo, siguen siendo herramientas significativas de la investigaci.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención HG008100 (J.W.G., L.M.H. y J.E.K. de la Biblioteca del Fondo Común de NIH).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Sistema robótico Arrayer utilizado en el protocolo | |
| Nikon HCA | Nikon | Sistema de imagen de alto contenido diseñado en torno al microscopio invertido Nikon Eclipse | |
| Ti BioTek Precision XS Liquid Handler | BioTek | robot de manejo de líquidos utilizado en el protocolo | |
| Trizma solución tampón de clorhidrato Sigma | T2069 | ||
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| Placa de microarray de 384 pocillos, pocillo cilíndrico | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 plato de pocillos | Thermo Fisher | 267062 | |
| solución de paraformaldehído al 16% | Microscopía Electrónica Ciencia | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Azida de sodio | Sigma | S2002 | |
| Máscara celular | Sondas moleculares | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Sondas moleculares | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | |
| ECM Colágeno I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Colágeno Tipo II | Millipore | CC052 | ECM |
| Colágeno Tipo III | Millipore | CC054 | ECM |
| Colágeno Tipo IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Colágeno Tipo V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectina | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Sistemas | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontina (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectina | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectina | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Trombospondina-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastina | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrilina | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligando |
| IL1B RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligando | |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligando |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | ligando |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | ligando |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | ligando |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | ligando |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | ligando |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | ligando |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligando |
| Wnt5A | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligando |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | ligando |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | ligando |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | ligando |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligando |
| IL7 RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligando | |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligando |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligando |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligando |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligando |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | ligando |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | ligando |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | ligando |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | ligando |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | ligando |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligando |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligando |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligando |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligando |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligando |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligando |
| TNF | RnD_ Systems_Own | 210-TA-020 | Ligando |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | ligando |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | ligando |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | ligando |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | ligando |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | ligando |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | ligando |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | ligando |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | ligando |
| IL6 RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | ligando | |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | ligando |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | ligando |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | ligando |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | ligando |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 |
Referencias
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Med....
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Reimpresiones y permisos
