Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

Summary

Этот протокол детализирует монослой, метод без сыворотки для эффективного создания гепатоцитов, как клетки из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (HPSCs) в 18 дней. Это влечет за собой шесть шагов, как hPSCs последовательно дифференцировать в промежуточных клеточных типов, таких как примитивные полосы, окончательный эндодерм, задний предтечут и печень бутон прародителей до формирования гепатоцитов, как клетки.

Abstract

Печень детоксикации вредных веществ, выделяет жизненно важные белки, и выполняет ключевые метаболические деятельности, тем самым поддерживая жизнь. Следовательно, печеночная недостаточность, которая может быть вызвана хроническим потреблением алкоголя, гепатитом, острым отравлением или другими оскорблениями– является тяжелым заболеванием, которое может привести к кровотечению, желтухе, коме и, в конечном счете, смерти. Тем не менее, подходы к лечению печеночной недостаточности, а также исследования функции печени и болезни, были загнаны в тупик отчасти из-за отсутствия обильных поставок клеток печени человека. С этой целью в этом протоколе подробно описывается эффективная дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в гепатоцитные клетки, руководствуясь дорожной картой развития, которая описывает, как судьба печени определяется через шесть последовательных шагов дифференциации. Путем манипулировать путями сигнализации развития для того чтобы повысить дифференциацию печенки и точно подавить образование излишних судеб клетки, этот метод эффектно производит населенности потомков бутона печени человека и гепатоцит-как клетки днями 6 и 18 дифференциации PSC, соответственно. Это достигается за счет временно точного контроля путей сигнализации развития, оказываемого малыми молекулами и факторами роста в среде культуры, свободной от сыворотки. Дифференциация в этой системе происходит в монослойных и дает гепатоцитов, как клетки, которые выражают характерные ферменты гепатоцитов и имеют возможность привить мыши модель хронической печеночной недостаточности. Способность эффективно генерировать большое количество клеток печени человека in vitro имеет последствия для лечения печеночной недостаточности, для скрининга наркотиков, а также для механистических исследований заболеваний печени.

Introduction

Цель этого протокола заключается в эффективной дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в обогащенных популяций печени бутон прародителей и гепатоцитов, как клетки². Доступ к готовым поставкам человеческих протеже печени и гепатоцитов, как клетки ускорят усилия по исследованию функции печени и болезни и может позволить новые клеточные трансплантации терапии для печеночной недостаточности^{3,4, 5}. Это оказалось сложной задачей в прошлом, так как hPSCs (которые включают эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клето....

Protocol

1. Подготовка дифференциации СМИ

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для получения информации о материалах и реагентах, используемых.

1. Подготовка базовых химически определенных носителей (CDM)
   ПРИМЕЧАНИЕ: CDM2, CDM3, CDM4 и CDM5 являются химически определенными носителями, которые используются в качестве базовых носителей для дифференциации hPSCs на клетки печени на различных стадиях. Состав этих носителей можно найти в таблице 1.
   1. Чтобы сделать CDM2 или CDM3, подготовить фондовый раствор, содержащий поливиниловый спирт (PVA). Растворите 0,5 г по....

Results

После 24 ч дифференциации APS, колонии, как правило, принимают различные морфологии, чем недифференцированные колонии сопутствующей с потерей яркой границы, которая обычно ограничивает hPSC колоний. Морфологически, примитивные полосы клетки, как правило, оборванные границы и более распространены и менее компактны, чем hPSCs-это флагов эпителиального к мезенхимальному переходу, как плюрипотентные эпибластские клетки дифференцировать и входить в примитивные полоса в vivo. Если размер колони.......

Discussion

Этот метод позволяет выравнять из гПСК обогащенные популяции пенитобудников, а затем и гепатоцитов. Способность генерировать обогащенные популяции клеток печени человека имеет важное значение для практического использования таких клеток. Предыдущие методы генерации гепатоцитов из hPSCs дали нечистых популяций клеток, содержащих как печень и не-печенных клеток, которые, после трансплантации в грызунов, дали кости и хряща в дополнение к ткани печени¹⁵. Поэтому явное подавление не-печенской дифференц.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2  μ m поровый мембранный фильтр	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Тиазовивин	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco или Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Добавка	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 питательная смесь, GlutaMAX™ Добавка	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Нокаут-заменитель сыворотки	Thermofisher Scientific	10828028
поливиниловый спирт	Sigma-Aldrich	P8136
Трансферрин	Сигма-Олдрич
Химически определенный липидный концентрат	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R& D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R& D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R& D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R& D	295-OM
Дексаметазон	Токрис	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman Chemicals	16457
Человеческий рекомбинантный инсулин	Sigma-Aldrich	11061-68-0