本研究は、高スループットを説明します呼吸器合胞体ウイルス (RSV) の中和抗体の力価を決定するためのマイクロ中和アッセイのイメージングに基づきます。このアッセイの形式は、別のサンプル タイプにテストされています。
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この記事について
サマリー
要約
呼吸器合胞体ウイルス特異中和抗体 (RSV NAbs) は、RSV に対する保護の重要なマーカーです。さまざまな分析フォーマットの数が現在使用中世界中があるので RSV NAbs を測定する正確かつ高スループット方法に必要性。RSV サブグループ A でテストされています、RSV サブグループ B の別のサンプル タイプも適合できるイメージング ベース微量中和試験をご紹介します。このメソッドは、10% 未満のものをされている参照抗測定間変動と、再現性が高いです。この試金は比較的低コストで、世界中の研究所で容易に確立できると考えています。RSV NAbs を測定、向上、高スループットの測定法の開発は、将来的に新規の RSV ワクチン候補の評価のために重要なあることと同様、国際的にこの方法の標準化のための重要な一歩前進を表します。
概要
呼吸器合胞体ウイルス (RSV) は、小児人口世界1の下気道感染症の主要な原因です。その高い負担にもかかわらずありませんまだワクチンや治療。2013 年以降、世界保健機関 (WHO) は回 WHO 協議会議2,の3の主要な研究の優先順位として RSV ワクチンの開発を宣言しています。WHO は、保護4の主要な血清学的マーカーと見なされると、rs ウイルス中和抗体 (NAb) の測定を使用してワクチンの免疫原性を監視するに合意しました。NAbs 抗 rs ウイルス抗体 palivizumab、現在のみ予防戦略利用できる4の臨床試験と同様、研究の数の厳しい RSV 感染に対する保護するために示されています。
5,6,7、8に挑戦の標準化の努力をした細胞および分子ベースのアッセイを含む世界中の研究所で使用される複数の NAb アッセイ フォーマットがあります。ただし、RS....
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プロトコル
注:すべての手順は、異なる記載がない限り BSL2 フードで行います。ウイルスの滴定は、PRN アッセイ PRN 試金で使用される最適の RSV の濃度を決定する前に必要です。一度解凍および各民放連試金のために使用される少量のウイルス株の約数を勧めします。1 つの研究からのすべてのサンプルの実行すべての民放連試金のため同じウイルス株を使用することをもお勧めします。文化メディアとリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) はセル板を追加する前に 37 ° C に温めていることを確認します。
1. RSV ウイルス滴定
注:ウイルス株の数は、重複の数によっては、図 1によると、アッセイ プレート設定できます。各ウイルス株は、最高のウイルス濃度 (すなわち、1:10) から始まるアッセイ プレートを 3 通で滴定する必要があります。シリアルの滴定が通常することができます 1:10。RSV 文化プロシージャと同様、A549 細胞培養およびメンテナンスを行う標準的な手順を使用して、このプロトコルには含まれません。
- 播種板 (日 1)
- ダルベッコ イーグルスの変更培地 (DMEM) + 10% 牛胎児血清 (FCS) + 4 × 10....
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結果
ウイルス ストックの滴定を 1:10 1:10 から行った8希釈 PRN アッセイ (典型的な結果を図 5に示すように) 前にウイルス ストック濃度を決定します。図 5から PFU カウントされることが確実に 1:10 の希釈液で4と 1:10 の5。同じ希釈で帳票の井戸から PFU の平均数を算出しました。1:105希釈された 14 のスポットの数の平均値、以来このウイルス株のウイルス価はとおり決定いた
14 (スポットの平均数)/[10-5 (希釈) 0.1 mL (菌量) x] 1.4 x 10 =7 PFU/mL
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ディスカッション
我々 は開発し、ほとんどの実験室に容易に合わせることができるシンプルかつ効率的なの RSV マイクロ中和のアッセイを最適化します。この試金はコンピューター化されたイメージのスキャンを使用して細胞レベルで民放連によるウイルス感染の阻害を測定し同様、ウイルスの感染能力を測定することができます。イメージング ベースのプラットフォームおよび特定抗体ベース システムの使用は、特異性と伝統的なプラーク検出方法6,7と比較してスポットの検出の感度を増加しています。これにより RSV の評価低い感染性を持つ株し、も PRN 試金で使用前に rs ウイルス濃度の定量の正確さを提供します。
RSV 株式間すべてバッチごとにバリエーションを最小限に抑えるため、各研究のウイルス ストックの同じバッチを使用することをお勧めします。アッセイの他の重要な側面は、ウイルス入力濃度、A549 細胞膜と同じカウントの設定を使用して試金の一貫性と正確性を確保するための整合性の整合性を含めます。プレートに.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、関与するすべての参加者をありがとうございます。我々 は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムを認めます。PVL は、NHMRC キャリア開発フェローシップ受領者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | ロット番号 60430286 |
| Reagents | |||
| Aceton | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor ロバ抗ヤギ IgG (4 °C;C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC ナトリウム塩粉末 | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (無血清、3.7 g/L NaHC、P/S) (4°C;C) | 科学サービス–在宅組織培養 | MCRI 内 | |
| Fetal calf Serum (-20 °C で 50 mL アリコートに保存;C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| ヒトポリクローナル抗血清 呼吸器合胞体ウイルス (RSV) (45 µL アリコート -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | 登録時にBEI Resourcesを通じて無料注文。この血清は、RSV(NR-32832) |
| M199粉末 | Life Technologies | 31100035 | |
| ミルク希釈剤ブロッキング溶液(4°Cで保存;C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| ニシリン/ストレプトマイシン(-20°Cで6mLアリコートに保存;C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O Milli-Q dispenser | Merck | 社内分注 | |
| 培養用 1x PBS 滅菌 (4 °C;C) | 科学サービス–家庭用組織培養 | MCRI | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General 消耗品 | |||
| Conical Falcon チューブ (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| フィルターユニット 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| 滅菌済み Eppendorf チューブ (1.5 mL) | オーストラリア PL | AM12400 | |
| 滅菌済み平底プレート (96 ウェル、蓋付き) | Interpath | 655180 | |
| 滅菌済み U 底プレート (96 ウェル、蓋付き) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL 血清学的ピペット | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL 血清学的ピペット | Interpath | 607180 | |
| 25 mL 血清学的ピペット | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 96TIPS PKG960 | フィッシャー バイオテック | TF-200-L-R-S | |
| チップピペット 5-20 & マイクロ;L クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 96TIPS PKG960 | フィッシャー バイオテック | TF-20-L-R-S | |
| チップピペット 100-1,000 & マイクロ;LClear Maxymum Recovery Racked 滅菌済み 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 & micro;L クリア マキシマム リカバリー ラック 滅菌済み 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot リーダ システム | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| マイクロソフトエクセル 2007 |
参考文献
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al.
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