ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.

Abstract

מבחני סטנדרט cytotoxicity, אשר דורשים את האוסף של lysates או תאים קבוע בנקודות זמן מרובים, מוגבלת הרגישות ויכולת להעריך גורמים המשפיעים על גורל עצביים. מבחני אלה דורשים התצפית של אוכלוסיות נפרדות של תאים בנקודות זמן בדידים. כתוצאה מכך, תאים בודדים לא יכול להיות במעקב פרוספקטיבי לאורך זמן, מגבילה מאוד את היכולת להבחין בין אם אירועים subcellular, כגון היווצרות puncta או חלבון mislocalization, הם פתוגניים הנהגים של המחלה, תגובות homeostatic, . או תופעות רק צירוף מקרים... מיקרוסקופ האורך תא בודד מתגבר על מגבלות אלו, ומאפשר החוקר לקבוע הבדלים הישרדות בין אוכלוסיות וצייר סיבתי קשרי גומלין עם רגישות משופרת. מדריך וידאו זה מתאר עבודה נציג לניסויים מדידה תא בודד ההישרדות של החולדה הנוירונים קורטיקלית הראשית המבטאת סמן חלבון פלואורסצנטי. הצופה למד כיצד להשיג יעילות גבוהה transfections, לאסוף, לעבד תמונות המאפשר איתור פוטנציאליים של תאים בודדים, ולהשוות את ההישרדות היחסי של אוכלוסיות עצביים באמצעות ניתוח סיכונים ביחס קוקס.

Introduction

מוות של תאים חריגים מהווה גורם המניע במחלות רבות, כולל סרטן, הקשורים ניוון מוחיים של קו¹. מבחני רגישות ועמיד עבור מוות תאים חיוניים האפיון של הפרעות אלה, כמו גם הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות תוך הרחבה או צמצום הישרדות הסלולר. כיום יש עשרות טכניקות למדידת מוות של תאים, באופן ישיר או באמצעות פונדקאית סמני². לדוגמה, מוות של תאים יכולים להידרש באופן חזותי עם העזרה של המשתמשות באופן סלקטיבי כתם תאים מתים או חיים³צבעים חיוני, או על-ידי ניטור את המראה של פוספוליפידים מסוימים קרום פלזמה^4,5,6 . מדידות של רכיבים תאי....

Protocol

כל העבודה בעלי חוליות אושרה על ידי הוועדה על שימוש ו טיפול חיות ב אוניברסיטת מישיגן (פרוטוקול # PRO00007096). ניסויים מתוכננים בקפידה כדי למזער את מספר החיות הקריב. בהריון הנשי פראי-סוג (WT), אוונס ארוך שאינו הטרנסגניים חולדות (Rattus norvegicus) שוכנות ביחידים צ'יימברס מצויד עם העשרה סביבתית, המטופלים על ידי היחידה עבור רפואה חיות מעבדה (אולם) ב אוניברסיטת מישיגן, ב בהתאם המדריך הנתמכות על-ידי NIH על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל העכברושים הוחזקו בשגרת דיור כמו זמן קצר ככל האפשר לפני המתת חסד, בקנה אחד עם ההמלצות של המנחים על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת מישיגן שיטות של המתת חסד על-ידי הנחיות מינים.

1....

Results

DIV4 החולדה הנוירונים בקליפת המוח באמצעות ההליך תרביות תאים המתואר כאן, היו transfected עם פלסמיד קידוד מאפל את חלבון פלואורסצנטי. החל 24 שעות שלאחר תרביות תאים, התאים היו עם תמונה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כל 24 שעות למשך 10 ימים רצופים. הדימויים הנובעת היו מאורגנים כמצוין איור 2, ואז תפור, מוערמים, הבקיע עבור מוות תאי (איור 1). איור 3 מראה קורס זמן עבור 3 נוירונים נציג, שניים אשר למות במה.......

Discussion

כאן מוצגת מתודולוגיה לעקוב ישירות אחר הישרדות העצבית על בסיס תא בודד. בניגוד מבחני מסורתי על מות תאים הנמצאים מוגבל זמן בדידים נקודות ועל אוכלוסיות שלמות של תאים, שיטה זו מאפשרת להערכה מתמשכת של מגוון גורמים כגון מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה, ו ניתן לקבוע כיצד כל גורם משפיע על הישרדות הסלולר באופן פרוספקטיבי.

מתודולוגיה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של צרכים ניסיוני. התדירות והמשך של הדמיה ניתן להתאים בקלות, כל חלבון עניין וניתן transfected שיתוף עם הסמן פלורסנט על .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal בינוני	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep פלסמיד ערכת מקסי	Qiagen	12863
מגנזיום כלוריד הקסהידראט	סיגמא	M9272
הידרט חומצה קינורן	TCI	H0303
פולי D-ליזין	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
ליפופקטמין 2000	Invitrogen	52887
תוסף B27	תרמו פישר	A3582801
פניצילין/סטרפטומיצין	GIBCO	15140122
96 צלחות באר	TPP	0876