Summary
الهدف الأساسي من هذه المقالة هو تقديم تفاصيل عنكيفية تسجيل الغشاء المحتملة (V م) من الشريان الدماغي الأوسط باستخدام طريقة الإمتصاسيم microelectrode. الشريان الدماغي الأوسط المُكَنَّد مُكَدَّد للحصول على نغمة مُجَرّة، وجدار الوعاء مُنَطَط باستخدام الأقطاب الدقيقة عالية المقاومة.
Abstract
الغشاء المحتمل(V م) من خلايا العضلات الملساء الوعائية يحدد لهجة الوعاء وبالتالي تدفق الدم إلى عضو. التغيرات في التعبير ووظيفة القنوات الأييون والمضخات الكهربائية التي تنظمV M في حالات المرض يمكن أن يغير من المحتمل Vم,لهجة الأوعية الدموية, وتدفق الدم. وهكذا، فهم أساسي للوظائف الفسجية الكهربائية والأساليب اللازمة لتسجيل بدقةV M في حالات صحية ومريضة ضرورية. هذا الأسلوب سوف يسمح تعديلV M باستخدام عوامل دوائية مختلفة لاستعادةV م. على الرغم من أن هناك عدة طرق، كل مع مزاياه وعيوبه، وتوفر هذه المادة بروتوكولات لتسجيلV M من السفن المقاومة cannulated مثل الشريان الدماغي الأوسط باستخدام طريقة impalement microelectrode. يسمح للشرايين الدماغية الوسطى للحصول على لهجة myogenic في غرفة myograph، ويتم اختراق جدار السفينة باستخدام microelectrodes عالية المقاومة. يتم جمع إشارةV m من خلال مقياس كهربائي، رقمنة، وتحليلها. توفر هذه الطريقة قراءة دقيقة لـ Vm لجدار السفينة دون الإضرار بالخلايا ودون تغيير مقاومة الغشاء.
Introduction
يشير احتمال الغشاء (Vm)من الخلية إلى الفرق النسبي للتهمة الأيونية عبر غشاء البلازما ونفاذية الغشاء النسبي لهذه الأيونات. يتم إنشاءV m عن طريق التوزيع التفاضلي للأيونات ويتم الحفاظ عليها بواسطة قنوات أيون والمضخات. قنوات ايون مثل K+، Na+، و Cl- المساهمة بشكل كبير في استراحةV م. الأوعية الدموية الخلايا العضلية الملساء (VSMCs) تعبر عن أكثر من أربعة أنواع مختلفة من K+ قنوات1, نوعين من الجهد بوابة Ca2 + قنوات (VGCC)2, أكثر من نوعين من Cl- قنوات3, 4 , 5،تخزين تشغيل هاتا2+ قنوات6،تمتد تنشيط قنوات الموجبة7،8،وكهربائي الصوديوم البوتاسيوم ATPase مضخات9 في أغشية البلازما الخاصة بهم، وكلها قد تكون تشارك في تنظيمV م.
Vm من VSMCs يعتمد على ضغط التجويف. في الأوعية غير المضغوطة، Vm يختلف من -50 إلى -65 mV، ومع ذلك، في شرائح الشريان المضغوط، تتراوحV m من -37 إلى -47 mV10. ارتفاع الضغط داخل الأوعية الدموية يؤدي VSMCs إلى إزالة الاستقطاب11، ويقلل من عتبة فتح VGCC ، ويزيد من تدفق الكالسيوم المساهمة في تطوير لهجة myogenic12. على العكس من ذلك، في الأوعية السلبية أو غير المضغوطة، الغشاء فرط الاستقطاب، بسبب ارتفاع K+ قناة النشاط، سوف تمنع VGCC من فتح، مما أدى إلى دخول الكالسيوم محدودة وانخفاض في الكالسيوم داخل الخلايا، مما يسهم في أقل الأوعية الدموية لهجة13. وهكذا، Vم بسبب التغيرات في ضغط التجويف يبدو أن تلعب دورا أساسيا في تطوير لهجة الأوعية الدموية، وكلا VGCC و K+ قنوات تلعب دورا حاسما في تنظيمV م.
Vm يختلف بين نوع السفينة والأنواع. VM هو -54 ± 1.3 mV في غينيا خنزير متفوقة شرائط الشريانية المساريقي14، -45 ± 1 mV في الشرايين الدماغية الوسطى الفئران في 60 مم زئبق ضغط التجويف12، و -35 ± 1 mV في الجرذان في الجرذان parenchymal الشرايين في ضغط التجويف 15 mmHg 40. وVمتر يستريح سجلت في العضلات اللمفاوية الفئران غير الممدودة هو -48 ± 2 mV16. Vm من VSMCs الدماغي هو أكثر سلبية مما كانت عليه في الشرايين الطرفية. وبالمقارنة، تم الإبلاغ عن أن الشرايين الدماغية الوسطى الماكرة لديهاV m من حوالي -70 mV، في حين تم الإبلاغ عن الشرايين المساريقية والتاجية لديها -49 و -58 mV، على التوالي17،18. الاختلافات فيV m عبر أسرة الأوعية الدموية قد تعكس الاختلافات في التعبير ووظيفة قنوات الأيون ومضخات الصوديوم والبوتاسيوم الكهربائية.
الزيادات والانخفاضات فيV m يشار إليها باسم الغشاء إزالة الاستقطاب وفرط الاستقطاب، على التوالي. هذه التعديلات فيV m تلعب دورا مركزيا في العديد من العمليات الفسيولوجية, بما في ذلك قناة الأيون gating, إشارة الخلية, تقلص العضلات, والعمل الانتشار المحتمل. في ضغط ثابت، العديد من مركبات موسعات الأوعية الذاتية والاصطناعية التي تنشط K+ قنوات تسبب فرط الاستقطاب الغشاء، مما أدى إلى توسع الأوعية1،13. وعلى العكس من ذلك، فإن إزالة الاستقطاب الغشاء المستمر أمر حيوي في الانقباض اتّبع أو التقلص اتّبع الأوعية19. Vm هو متغير حاسم لا ينظم فقط تدفق Ca2+ من خلال VGCC13 ولكن أيضا يؤثر على الافراج عن Ca2+ من المتاجر الداخلية20،21 و Ca2+حساسية من جهاز التقلص22.
في حين أن هناك عدة طرق لتسجيلV M من أنواع مختلفة من الخلايا، والبيانات التي تم جمعها من طريقة impalement microelectrode من السفن cannulated يبدو أن أكثر الفسيولوجية من البيانات التي تم الحصول عليها من VSMCs معزولة. عندما سجلت من VSMC معزولة باستخدام أساليب المشبك الحالي، وينظرV m كما فرط الاستقطاب اتانعم يعابر في VSMCs24. VSMCs معزولة ليست في المزامنة، والتغيرات في المقاومة سلسلة قد تسهم في السلوك التذبذب منV m. من ناحية أخرى، لا يلاحظ السلوك التذبذب عندما يتم تسجيلV m من السفن سليمة، وربما يرجع ذلك إلى اتصال خلية الخلية بين VSMCs التي هي في التزامن في الشريان ويتم summated في جميع أنحاء السفينة مما يؤدي إلى ثابت Vم 24- وبالتالي، فإن قياسمتر V من الأوعية المضغوطة باستخدام تقنية التكوّل الكهربائي الصغير المعياري ة قريب نسبيا من الظروف الفسيولوجية.
تسجيل VM من الأوعية cannulated يمكن أن توفر معلومات حيوية، منذV م من VSMCs التي هي في التزامن هي واحدة من المحددات الرئيسية لنغمة الأوعية الدموية وتدفق الدم، والتشكيل منM V يمكن أن توفر وسيلة لتمدد أو انقباض الأوعية الدموية. وبالتالي، فمن الضروري أن نفهم المنهجية التي ينطوي عليها تسجيلV م. يصف هذا مادة تسجيل [إينترسلّوكل] من [ف][م] من [كنتّلتد] [مكّين] شرايين ([ككم]) يستعمل [ميكروكتّر] [إيمّلمنت] طريقة. هذا البروتوكول سوف يصف كيفية إعداد MCAs، microelectrodes، إعداد مقياس الكهرباء وأداء طريقة impalement لتسجيلV م. أيضاً، يتم مناقشة البيانات التمثيلية، والمشكلات الشائعة التي تمت مواجهتها عند استخدام هذا الأسلوب والمشكلات المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم إيواء الجرذان الذكور في مرفق رعاية الحيوانات في UMMC، الذي وافقت عليه جمعية تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية (AAALAC). وكان للالحيوانات حرية الحصول على الغذاء والماء طوال الدراسة. تم الحفاظ على الحيوانات في بيئة خاضعة للرقابة مع درجة حرارة 24 ± 2 درجة مئوية، ومستويات الرطوبة من 60-80٪ و 12 دورة ضوء / الظلام. وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في الاتحاد على جميع البروتوكولات.
1. إعداد المعدات
- وضع مزدوج قناة التفاضلية الكهربائي مكبر للصوت (انظر جدول المواد) على مقربة منغرفة السفينة وفي الموقع المطلوب.
- قم بتوصيل إخراج قناة مكبر الصوت A أو B بمدخل القناة من جهاز التحويل الرقمي مع كابل BNC-BNC.
- جبل التحقيق في micromanipulator ووضعها بالقرب من المجهر وmyograph. يجب تثبيت إعداد التسجيل على جدول خالي من الاهتزاز.
- وضع المقابض ومفاتيح على الجزء الأمامي من مكبر للصوت في المواقف التي تكوينه لهذه التجربة كما هو موضح في الدليل.
- ربط الأرض حمام إلى الأرض الدائرة من مكبر للصوت عن طريق مع قطب مناسب. وبالمثل، تأكد من أن القفص هو على الارض إلى هيكل مكبر للصوت.
2. إعداد الأقطاب الدقيقة والتجمع
-
استخدم الأقطاب الدقيقة المصنوعة من البورسليكات (انظر جدول المواد) واسحب طرف الزجاج لتبلغ قطره 8-10 مم، وقطره <1 ميكروم ومقاومة 80-120 MΩ عند ملئه بـ 3 م ك.كل.
- استخدام سحب القياسية لتحقيق تفتق تدريجي قصيرة باستخدام الإعدادات التالية: الحرارة = 650; السرعة = 20؛ سحب = 25; الوقت = 250 وحلقة مرتين لمقاومة أعلى وأصغر نصائح. انظر جدول المواد كإعدادات خاصة بالصك.
ملاحظة: سوف تسبب أقطار البقشيش <1 μm الحد الأدنى من الضرر للخلية عند الإنفسيد.
- استخدام سحب القياسية لتحقيق تفتق تدريجي قصيرة باستخدام الإعدادات التالية: الحرارة = 650; السرعة = 20؛ سحب = 25; الوقت = 250 وحلقة مرتين لمقاومة أعلى وأصغر نصائح. انظر جدول المواد كإعدادات خاصة بالصك.
-
ملء ميكروكتريكت مع 3 M KCl باستخدام حقنة ستوكات (انظر جدول المواد).
- سحب ببطء المكبس من المحاقن ستوكات حتى أثناء حقن 3 M KCl في microelectrode للسماح مساحة للسائل لملء ومنع تشكيل فقاعات الهواء داخل microelectrode.
- ملء microelectrode حتى الكامل وضمان عدم وجود فقاعات الهواء قبل وضعه في حامل microelectrode. إذا كانت الفقاعات موجودة، فاضغط برفق على الميكروتكترود بإصبع لإزالة الفقاعات.
- ممارسة الرعاية، ودفع بقوة ساق القطب في حامل من خلال ثقب بالملل. إذا كان السوائل الزائدة موجودة، قم بإزالته بنسيج.
- قم بتوصيل تجميع حامل الأقطاب الكهربائية بمسبار مكبر الصوت. إجراء اختبار القطب الكهربائي، وضبط إزاحة الإدخال، والتحقق من الإعداد صفر والتحقق من تسرب المدخلات التحقيق وفقا لدليل مكبر للصوت.
- قياس مقاومة الأقطاب الكهربائية باستخدام اختبار القطب كما هو موضح في الجدول1.
- لاحظ أن قطب يعمل يعرض إزاحة الجهد DC إيجابية من 1 mV /MΩ في إخراج القناة. من ناحية أخرى، إذا ظهر جهد كبير في إخراج القناة وعلى العداد، وهذا يشير إلى قطب مسدود أو مكسور.
- افتح برنامج التسجيل، وقم بتعيين اسم إلى الملف واحفظه لتحليله في المستقبل في برنامج تخزين.
3. عزل وقنينة الشريان الدماغي الأوسط
-
إعداد الكواشف.
- إعداد محلول ملح فسيولوجى للكالسيوم الطبيعي والمنخفض (PSS) كما هو موضح في الجدول 2.
-
جهزي الـ"ميوغراف"
- شطف غرفة myograph (انظر جدولالمواد) مع الماء المقطر عدة مرات للحفاظ على أنها خالية من الحطام. تحميل الغرفة مع 5 مل من PSS العادي.
- املأ كلا الكانولا الزجاجي ينبذ بـ PSS العادي ة بحقنة 5-10 مل. ملء بعناية كامل قنية والأنابيب المرفقة دون إدخال أي فقاعات الهواء.
- إعداد اثنين من خيوط النايلون حيدة (10-0، 0.02 ملم) مع نصف عقدة كل باستخدام ملقط حادة.
- ضع عقدة الخياطة المغلقة جزئيًا على كلا الخطين بعيدًا قليلاً عن الطرف باستخدام ملقط التشريح تحت مجهر التشريح. في وقت لاحق سيتم انزلق هذه العقد قبالة وتعادل بعناية على نهايات الشرايين cannulated لتأمين السفينة.
-
عزل وتأسي الشريان الدماغي الأوسط.
- إحداث تخدير عميق في الفئران سبراغ دولي باستخدام 2-4٪ استنشاق isoflurane.
- قطع رأس الجرذ باستخدام المقصلة تحت التخدير العميق.
- إزالة بعناية الجمجمة باستخدام قطع العظام ومقص.
- إزالة الدماغ من الجمجمة ووضعها في 5 مل من PSS الكالسيوم منخفضة على الجليد.
- تحديد وتشريح جزء غير متفرع من الشريان الدماغي الأوسط للفئران (MCA) بقطر داخلي يتراوح بين 100 و200 ميكرومتر من الدماغ باستخدام مقص الربيع وملقط.
- جبل MCA على cannulas الزجاج باستخدام ملقط غرامة وآمنة عن طريق تشديد الغرز في myograph التي تحتوي على PSS العادي.
- أغلق القنية البعيدة بحيث لن يكون هناك تدفق داخل MCAs.
- توصيل ماصة التدفق إلى خزان يحمل PSS للسماح للتحكم في الضغط داخل المنار الذي سيتم رصده باستخدام محول ضغط في الخط.
- تصور MCAs cannulated باستخدام كاميرا الجهاز تهمة مقرونة (انظر جدولالمواد) التي شنت على المجهر مقلوب والبرمجيات التصوير.
- تعيين طول محوري من MCA إلى طول تقريبي حيث ينبغي أن تظهر لا جامدة ولا رخوة.
- توازن حل الحمام مع O2 (95%) وثاني أكسيد الكربون (5 في المائة) عند 37 درجة مئوية لتوفير الأكسجة الكافية، ودرجة الحرارة والمحافظة على درجة الـ 7.4 درجة مئوية.
-
إمبالي (اختراق غشاء بلازما الخلية) خلايا العضلات الملساء الوعائية.
- قم بتوصيل القطب الأرضي وابقائه مغموراً في PSS من myograph.
- تضيء غرفة السفينة وننظر من خلال المجهر لتصور غيض من microelectrode في محلول الحمام.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تصور MCA وmicroelectrode على جهاز كمبيوتر وجود برنامج التصوير. - استخدام الضوابط من micromanipulator لنقل غيض من microelectrode بالقرب من الجدار الخارجي للأوعية الدموية. يجب أن يكون micromanipulator وطرف microelectrode في وضع مستقر بالنسبة للأنسجة.
ملاحظة: قبل بدء التجارب، تأكد من أن الجهد الغشاء قد استقرت. إذا كان الجهد المقيس غير مستقر، فإن الاتصال بين القطب الكهربائي والخلية غير مختوم، مما يشير إلى حدوث تسرب. - ابدأ التسجيل.
- تحرك ببطء غيض من microelectrode نحو السفينة، وتهدف إلى مركز السفينة باستخدام مسار أو السيطرة الدقيقة من micromanipulator.
ملاحظة: في بعض الأحيان، يمكن ملاحظة انحراف صغير في التسجيل عندما يتصل طرف ميكروإلكتركت بغشاء من ألياف العضلات. - عندما يأتي الطرف على مقربة من السفينة، تقدم القطب إلى الأمام في حركة واحدة سريعة باستخدام micromanipulator لإمبل غشاء العضلات.
- عند هذه النقطة، يمكن للمرء أن يبدأ في مراقبة التغييرات فيV m يتم تسجيلها. لا تلمس الميكرومتتورتور عندما يقوم الإلكتروكت الكهربائي الدقيق بإملاك غشاء الخلية.
ملاحظة: الفرق في الجهد بين تسجيل والقطب المرجعي يقلل من 0 mV إلى ما بين -40 mV و -75 mV اعتمادا على مستوى الضغط داخل الأوعية الدموية أو غيرها من المحفزات المثيرة أو المثبطة. هذه القراءات تميز الفرق المحتمل عبر الغشاء للخلية الحالية. - تنفيذ العديد من التشوهات على سفينة واحدة في مناطق مختلفة من السفينة دون الإضرار VSMCs من أجل الحصول على قياسات دقيقة.
- بعد التسجيل، استخدم المتلاعب لإزالة ميكروتكترود في حركة واحدة سريعة.
- إيقاف التسجيل وحفظ ملفات البيانات لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام الطريقة المقدمة بشكل موثوق لتسجيلV m في السفن cannulated. يتم عرض إجراء موجز يصف كيفية عزل MCA من الدماغ في الشكل 1A. بعد فصل الدماغ عن الجمجمة، تم تشريح MCA ووضعها في طبق بيتري الذي يحتوي على PSS منخفضة الكالسيوم. كما تم تشريح جزء من النسيج الضام الذي تم إرفاقه جنبا إلى جنب مع MCA باستخدام مقص الربيع وملقط لمنع الأضرار التي لحقت MCA أثناء العزلة. بعناية، تمت إزالة النسيج الضام أيضا، وMCA تشريح كان على استعداد لنقل إلى myograph. تم تركيب MCA على الكانوللاس وربطت باستخدام عقدة خياطة على طرفي كانولاس في myograph. يظهر في الشكل 1Bتمثيل تخطيطي لإعداد طريقة التكوّل الكهربائي الصغير النموذجي . تم توصيل ميكروالقطب مملوء ة بـ 3 م ك كل بمقياس الكهرباء بواسطة حامل في المسبار. تم توصيل إخراج القناة من مقياس الكهرباء إلى قناة إدخال التناظرية من جهاز التحويل الرقمي باستخدام كابل BNC-BNC. كما تم ربط إخراج جهاز التحويل الرقمي بمنظار الذبذبات لتصور الإشارة في برنامج التسجيل. تم تأسيس الأرض باستخدام سلك بيليه AgCl التي تم تمديدها من هيكل الكهربائي إلى حل حمام في myograph. وأخيرا، تم تصور الآثار الرقمية في برنامج التسجيل على شاشة الكمبيوتر.
ثم تم احتضان MCA في PSS الدافئة أعدت حديثا وكان الضغط إلى 60 ملم زئبق. فقط السفن التي تكتسب لهجة استخدمت لتسجيلV M. بعد أن اكتسبت السفينة لهجة كبيرة، تم التقدم microelectrode في جدار السفينة. تم تصور القطر الشرياني واختراق الشريان باستخدام المجهر الفيديو. ويعتبر الإمبامينت ناجحة عندما يكون هناك انحراف سريع إلى القيم السلبية، Vm هو مستقر ل ≥30 s، والجهد يعود فجأة إلى 0 mV عند إزالة القطب كما هو مبين في الشكل 212،15. وتشير نتائجنا إلى أنه في MCA التي يتم الضغط على 60 مم زئبق،وV m هو ~ -43.2 ± 2.9 mV.
بعد [إمبلممنت] ناجحة و [ف][م] استقرار, ال [برّووس] العقاقير أنّ يغيّر ال [ف][م] كان في الحمام وتغيرات في ال [ف][م] كان سجّلت. استخدمنا 20 m KCl لإزالة الاستقطاب و 20 μM NS1619، وهو الاصطناعية كبيرة التوصيل البوتاسيوم قناة فتاحة، لفرط استقطاب الغشاء. نتائجنا تشير إلى أن انحش الغرفة مع KCl depolarized الغشاء من قبل ~ 5.8 ± 0.18 mV. من ناحية أخرى، والتسريب مع NS1619 فرط استقطاب الغشاء من قبل ~ 3.8 ± 0.4 mV.
الشكل 1: رسم توضيحي لعزل الشرايين الدماغية الوسطى وتسجيل الأغشية الكامنة باستخدام طريقة التكليك الكهربائي . (أ) باستخدام مقص الربيع، وقطع الدماغ أو النسيج الضام على طول الخطوط المنقطة. نقل وتركيب MCA بين الزجاج ينوب تين وتأمينه باستخدام الغرز في غرفة myograph مليئة PSS. (ب) يتم إدخال ميكروالقطب مملوء ة3 M KCl في حامل ومتصل إلى التحقيق. التغيرات في السفر عبر الغشاء المحتملة من المسبار إلى مقياس كهربائي وإلى جهاز التحويل الرقمي عبر كابل BNC (يتم توصيل كابل BNC من إخراج قناة من الكهربائي وإلى إدخال التناظرية من جهاز التحويل الرقمي). وترى الإمكانية الرقمية في برنامج التسجيل على الشاشة. تم تأسيس الأرض باستخدام سلك بيليه AgCl متصلة من الكهربائي إلى حل حمام في myograph. MCA = الشريان الدماغي الأوسط. PSS = حل الملح الفسيولوجية. الكلوريد الفضي الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تسجيل احتمالية الغشاء باستخدام طريقة التكليك الكهربائي الدقيق من الشرايين الدماغية الوسطى. أثر تمثيلية من [ف][م]. ويعتبر الإمبامينت ناجحة إذا كان هناك انحراف مفاجئ إلى القيم السلبية عند دخول القطب، Vm مستقرة ل ≥30 s، والجهد يعود فجأة إلى 0 mV عند إزالة القطب. يمثل المحور X الوقت، ويمثل المحور Y إمكانية الغشاء. ويمثل الخط المنقط خط الأساس المعدل قبل أن يكون قد تم اختراق السفينة. ثانية = ثواني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيل التغيرات في الغشاء المحتمل باستخدام طريقة التكليك الكهربائي الجزئي عندما تتعرض الأوعية للعوامل النشطة في الأوعية الدموية. تم تسجيل Vm باستخدام طريقة التخثر الكهربائي من الشرايين الدماغية الوسطى قبل وبعد التعرض للعوامل النشطة في الأوعية. يمثل تتبعالعينة ( A) إزالة الأقطاب استجابة لـ 20 مل KCl و (B)فرط الاستقطاب استجابة لـ 20 ميكرومتر NS1619 — وهو مؤثر قناة البوتاسيوم موصل كبير. (C) ملخص شريط الرسم البياني للتغيرات فيV m قبل وبعد تطبيق KCl و NS1619. يمثل الخط المنقط يستريح Vم. الرقم في قوس يمثل عدد السفن المستخدمة في الدراسة. لاحظ أنV m وصلت خط الأساس بمجرد غسل الدواء. يمثل شريط الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. ثانية = ثواني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| إعدادات مقياس كهربائي لقياس مقاومة الأقطاب الكهربائية | |
| متر الإدخال | القناة ألف أو ب |
| تبديل الموضع | في |
| متر المدى | التبديل إلى 200 mV |
| القطب | في الحمام |
| وضع | تشغيل لاختبار القطب الكهربائي |
| مؤشر متر | 1 مف / مم |
الجدول 1: إعدادات مقياس كهربائي لقياس مقاومة الأقطاب الكهربائية.
| المواد الكيميائيه | انخفاض الكالسيوم PSS mM | PSS العادي ة | الشركه | كتالوج | |
| 1 | كلوريد الصوديوم | 119.00 | 119.00 | سيغما | S7653 |
| 2 | KCl | 4.70 | 4.70 | سيغما | P4504 |
| 3 | MSO4 | 1.17 | 1.17 | سيغما | M7506 |
| 4 | الكاكل2 | 0.05 | 1.60 | سيغما | C3881 |
| 5 | HEPES | 5.00 | 5.00 | سيغما | H7006 |
| 6 | الجلوكوز | 10.00 | 10.00 | سيغما | G7021 |
| 7 | NaH2PO4 | 1.18 | 1.18 | سيغما | S0751 |
| 8 | نامكو3 | 18.00 | 18.00 | سيغما | S5761 |
| حنس: 7.4 | حنس: 7.4 |
الجدول 2: الكواشف المستخدمة في إعداد محلول ملح فسيولوجى منخفض الكالسيوم وطبيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر هذه المقالة الخطوات اللازمة حول كيفية استخدام طريقة حادة للتخميد ميكروالقطب لتسجيلV m من إعداد وعاء cannulated. ويستخدم هذا الأسلوب على نطاق واسع، ويقدم عالية الجودة، وتسجيلات متسقة منV m التي تجيب على مجموعة واسعة من الأسئلة التجريبية.
يتم وصف بعض الاعتبارات الهامة و خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها هنا لضمان نجاح الأسلوب. نوعية الميكروتكترود (حدته والمقاومة) وعملية الخلوية التي تخترق تأثير الاستقرار والدقة منV م. إذا كانت الإشارة تنجرف باستمرار أو أعلى أو أقل من نطاق تسجيل مكبر للصوت، فمن المرجح أن يتم حظر القطب الكهربائي، أو أن يتم كسر الطرف. إذا كان الإمكلامنت جزئيًا أو غير كافٍ أو يضر بالخلية، فإن احتمال حدوث ذلك يرتفع إلى 0 mV مما يؤدي إلى عدم استقرار الإشارة أو عدم وجود إشارة. في بعض الحالات، يمكن لمحتويات الخلية أيضا منع القطب مقاومة عالية جدا. كل هذه المشاكل يمكن التغلب عليها بمجرد استبدال القطب مع واحد جديد.
للاختراق الناجح ، يجب على المرء التأكد من أن المقاومة الكلية لغشاء الخلية غير متغيرة ، وإمكانية الغشاء المقيس مستقرة مع عدم وجود تسرب بين القطب الكهربائي والغشاء. من المهم أن يتم تقدم القطب نحو الخلية من قبل micromanipulator مستقرة. عندما متقدمة إلى داخل ميكرومتر قليلة من الخلية، فإن احتمال غيض تغيير مما أدى إلى انحراف طفيف في الجهد الكشف عنها. لتجنب إتلاف طرف القطب الكهربائي أو تمدد غشاء الخلية، مطلوب التقدم السريع للقطب الكهربائي. يتميز الإنفجار الناجح بانخفاض سريع في إمكانات الغشاء يليه استقرار حول إمكانات الاسترخاء في الغشاء. إذا كانت القراءة المحتملة تتقلب، فمن الممكن أن غيض من القطب قد تعطل تشقق الغشاء مما تسبب في تسرب الصوديوم إلى الخلية والبوتاسيوم لتسرب من الخلية، مما أدى إلى إزالة الاستقطاب التدريجي. مشكلة أخرى في هذا الأسلوب هو أن تقاطع إمكانات وإمكانات تلميح القطب يمكن إضافة قطعة أثرية لا لزوم لها إلى تسجيلV م. تحدث احتمالات التقاطع عندما يتم الاتصال بالموصلات المختلفة. هناك نوعان مختلفان من إمكانات التقاطع، السائل والمعدن السائل السائل. يتم تشكيل تقاطعات المعادن السائلة عندما يتصل طرف المسبار بالكهرباء في الميكروبيبيت. تحدث تقاطعات السائل السائل، وتسمى أيضا إمكانية تقاطع السائل، عندما اثنين من الحلول من تركيزات متفاوتة تأتي في اتصال. ويسهم نشر الأيونات بين الحلول في تطوير الإمكانات. إلى جانب ذلك، خصائص تلميح القطب الزجاجي التفاعل مع السائل يمكن أن تولد إمكانات طرف. لتقليل تقاطع وكذلك احتمالات طرف, الصفر من إمكانات قياس في الحمام يمكن أن تقلل من التحيز غير المرغوب فيها. أثناء الإنخماس، لا يمكن للمرء أن يستبعد إمكانية أن بطانية، بدلا من العضلات الملساء، Vm يمكن أن تكون عن غير قصد عينات في بعض التجارب. ومع ذلك، تشير الدراسات إلى أن طبقات البطانة وVSMC تقترن كهربائيا في الشرايين الصغيرة وأظهرت مماثلة VM الاستجابات23.
وفي نهاية المطاف، فإن ثلاث خطوات في هذه العملية حاسمة لتحقيق تسجيلات ناجحة. أولا، يجب أن تكون السفن مستعدة على النحو المناسب، مع ضمان عدم إلحاق الضرر بها أثناء العملية. ثانيا، يجب سحب microelectrodes إلى الخصائص الكهربائية الحق. وأخيراً، فإن الإمشقة السريعة للغشاء دون كسر الطرف أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج دقيقة. يجب على المحقق فهم الفيزيولوجيا الكهربائية، وكيفية إنشاء الأقطاب الدقيقة قابلة للحياة، وكيفية إعداد واستخدام مقياس كهربائي.
وعلى الرغم من أهميتها، فإن هذه الطريقة لها قيود مختلفة. أولا، التكلفة الإجمالية لشراء جميع المعدات مرتفعة (~ 30-40,000 دولار). ثانيا، هناك حاجة إلى سفن جديدة لجميع هذه التجارب؛ وبالتالي يتم قتل الحيوان في كل تجربة، إضافة إلى التكلفة الإجمالية. ثالثا، تشريح الشرايين الدماغية، وتصنيف الأوعية مملة، ومكلفة ولها منحنى التعلم. رابعا، إعداد microelectrodes، impalement، وتسجيلV م يتطلب فهما شاملا للفيزيولوجيا الكهربائية. وأخيراً، لإنشاء هذا الإعداد في المختبر يتطلب الموظفين المتفانين، والوقت والجهد.
Vm هو خاصية كهروفيزيولوجية أساسية تحدد نغمة الأوعية الدموية وبالتالي تدفق الدم إلى عضو. Vm يمكن أن تتغير من قبل العديد من المواد الكيميائية النشطة في الأوعية التي يتم تحريرها من الخلايا العصبية, البطانة ومكونات الدم. في حين أن الانقباضات الأوعية depolarize الغشاء، الموسعات فرط استقطاب الغشاء. العديد من البروتينات بما في ذلك K+ قنوات، VGCC، ATPase البوتاسيوم الصوديوم، Ca2 + ATPase، CL- قنوات، مخزن التي تديرها وقنوات تمتد تنظيمV م. التعديلات في أي من هذه البروتينات في حالات المرض يمكن أن يغير يحتمل Vم وبالتالي لهجة الأوعية الدموية وتدفق الدم. طريقة الإمفالمنت الميكروالقطب مفيد لتسجيل يستريح وكذلك التغييرات فيV م ردا على الأوعية والموسعات. لذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل موثوق لفهم العادية والمتغيرةV م المرتبطة بالمرض، وقد تكون مفيدة في تطوير العوامل الدوائية المصممة لتعديلVم، لهجة الأوعية الدموية وتدفق الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المقدمة من برنامج أبحاث الدعم الداخلي (IRSP) من UMMC، AHA منحة تطوير العلماء (13SDG1400006) التي منحت لمليكارجونا ر. بابيدي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , Taylor & Francis. (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T.
