Enteroids 人間の病気の研究に新たなモデルとして浮上しています。プロトコルでは、新生児の組織から生成された enteroids のリポ多糖 (LPS) 治療を使用して人間の壊死性腸炎の enteroid モデルをシミュレートする方法について説明します。収集した enteroids は、人間の壊死性腸炎で見られるそれらと同類の炎症性変化を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
壊死性腸炎 (NEC) は、新生児の壊滅的な病気です。反発、障害、細胞死の増加は高められた腸の透磁率につながる人間の腸上皮の複数の病態生理学的変化によって特徴付けられます。NEC の多数の動物モデル、種の間高い変数傷害および治療上の介在への応答可能性があります。さらに、疾患の病態やヒト、特に子供たちに直接新規の治療薬を研究する倫理的挑戦です。したがって、人間のティッシュを使用して NEC の新たなモデルを開発する非常に望ましいです。Enteroids は、腸管上皮細胞由来三次元 organoids です。彼らは、複雑な生理学的な相互作用、細胞シグナリング、およびホスト病原体の防御の研究に最適です。本稿で述べるプロトコルその文化人間 enteroids 腸切除を受けた患者からの腸管幹細胞の隔離の後。ひと腸管上皮のさまざまなセルの種類のネイティブへの分化を促す成長因子を含んでいる媒体で陰窩細胞を培養しています。これらの細胞は、細胞外の基底膜を模倣、足場として機能する蛋白質の合成、コラーゲン ミックスで栽培されています。その結果、enteroids は、頂基底極性を開発します。メディアのリポ多糖 (LPS) の共同管理は、enteroids、組織学的、遺伝的につながるとタンパク質発現変化人間 NEC で見られるそれらに類似の炎症反応を引き起こします。人間のティッシュを使用して NEC の実験モデルとして、この病気の治療法を識別する薬と治療の人間の試験の前にテストのためのより正確なプラットフォームがあります。
概要
人間 enteroids、ex vivo 3次元培養システム人間の腸組織サンプルの腸陰窩から分離された幹細胞から生成されます。この画期的モデル マウス1小腸の陰窩に Lgr5 幹細胞の発見に続く 2007 のハンス Clevers らの先駆者だった。自分の仕事は元の確立のための基礎を築いた重要な遺伝的または生理学的な変更2継代できる複数のセル型の vivo 腸管上皮文化。この発見以来 enteroids は、通常の消化生理学や再生医療2ホスト病原体の相互作用、炎症性腸疾患などの腸疾患の病態生理を研究する新たなモデルとして使用されています。
使用例として enteroids の消化管病態生理学の研究のための生体モデル代替技術いくつか利点があります。過去数十年の動物モデルと不死化腸癌由来細胞株は、腸の生理3,4,5を勉強する使用されています。単一細胞培養は、それにより細胞のクロストークとタンパク質発現、シグナル伝達、病原体による疾患6セグメント特異性に欠けている細胞の種類通常の腸の粘膜上皮に存在の多様性を表....
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プロトコル
施設内審査委員会の承認が得られた (IRB #2013 15152) アンとロバート H. Lurie こどもホスピタル オブ シカゴ、シカゴ、イリノイで腸切除術を受けた患者の組織サンプルのコレクションのため。すべてのプロトコルは、制度と国家のガイドラインおよび人類の福祉のための規則に準拠して行われました。書かれた情報に基づいた保護者の同意が求められ、すべてのケースでサンプル コレクションの前に得られます。
1. 試薬の準備
- 文化メディア ストック ソリューション全体の組織コレクションの準備: 1 L のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、110 mL の胎仔ウシ血清 (FBS) のペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) の 11 mL1.1 ml フィルター滅菌インスリン (最終濃度 0.1%)4 ° C で原液を保存します。
- キレート バッファー #1 を準備: 文化、メディア (前述 1.1) 30 mL 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 600 μ L (最終濃度 10 mM)、300 μ L (終濃度 1%) ゲンタマイシンのアムホテリシン b (最終濃度 0.2%) 60 μ L。4 ° C で原液を保存します。
- キレート バッファー #2 の準備: 30 mL の培地 (1.1 で説明します) と、ゲンタマイシン (最終濃度 1%) の 0.5 M EDTA (最終....
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結果
めっき直後後新鮮単離腸陰窩は細長い棒として表示されます。時間以内に、円形の外観 (図 1、) で、enteroid になります。次の数日間、enteroids を図 1bに見られるように球を形成して開始します。新進は、5-10 日 (図 1c) の発生が、enteroid コレクションは、その時に発生します。
成長している enteroids も集中ルーメン、頂の境界線および基底のドメイン (図 2) を含む極性を展示いたします。Enteroids はまた、堅牢なアクチン細胞骨格 (
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ディスカッション
Ex vivo ひと腸 enteroid モデルこの小説は、壊死性腸炎 (NEC) の腸粘膜バリアー障害の研究のための有用な方法として機能します。ここで紹介する enteroid 処理方法は、夫妻ミスティ良い、マイケル ・ Helmrath、ジェイソン ヴェルトハイムの10、11,12の前の仕事から合わせられました。
詳細全体を取り巻く組織の採取と地下室の分離のタイミングは、このプロトコルの重要なステップです。組織を手術切除の時にすぐに収集され、組織は研究室に到着するとすぐに地下室分離処理する必要があります。我々 はこのモデルのより小さい 3 ヶの患者から組織を選択しました。遅延処理は、全体組織の採取後 24 h 内で発生することが必要な場合。さらに、人体組織サンプルの品質は、地下室の分離の収量を大きく影響します。健康的な小腸基礎となる病理学と若い患者 (< 生後 2 か月) 最高の結果が得られる.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、糖尿病、消化器・腎臓病グラント (K08DK106450) C.J.H. にアメリカの小児外科協会からジェイ Grosfeld 賞の健康研究所の国立研究所によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4% パラホルムアルデヒド | サーモフィッシャー | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| アムホテリシン B | サーモフィッシャー | 15290026 | |
| B-27 サプリメント マイナス ビタミン A | サーモフィッシャー | 17504-044 | |
| 基底膜マトリックス (マトリゲル) | コーニング | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | サーモフィッシャー | MT-16-405-CV | |
| ダルベッコ'S モディファイド イーグル ミディアム (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| ダルベッコThermoFisher | 14190-144 | ||
| 上皮成長因子 (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| ゲンタマイシン | Sigma G5013-1G | ||
| GlutaMAX (L-グルタミン) | サーモフィッシャー | 35050-061 | |
| インスリン | シグマ | I9278-5mL | |
| [leu] 15-ガストリン 1 | シグマ | G9145-.1MG | |
| リポ多糖 (LPS) | シグマ | L2630-25MG | |
| N-2 サプリメント | サーモフィッシャー | 17502-048 | |
| N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸 (HEPES) | サーモフィ | ッシャー15630-080 | |
| N-アセチルシステイン | シグマ | A9165-5G | |
| ニコチンアミド | シグマ | N0636-100G | |
| ノギン | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | ThermoFisher | 15140-148 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| ティッシュプロセッシングゲル(ヒストゲル) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&Dシステムズ社 | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | シグマ | Y0503-1MG |
参考文献
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. ....
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