Summary
هذا البروتوكول تفاصيل المنهجية للتحديد الكمي للسلوك الحركي والنوم في كافيفيش المكسيكية. يتم توسيع التحليلات السابقة لقياس هذه السلوكيات في الأسماك يضم اجتماعيا. يمكن تطبيق هذا النظام على نطاق واسع لدراسة النوم والنشاط في الأنواع الأخرى.
Abstract
عبر يعج، يتميز النوم يحافظ على درجة عالية من الخصائص السلوكية التي تشمل عتبة الاستثارة مرتفعة، وانتعاش بعد الحرمان من النوم، وتوحيد فترات الجمود السلوكي. كافيفيش المكسيكية، أستياناكس مكسيكي (مكسيكي) أ ()، نموذج لدراسة تطور سمة استجابة لاضطراب البيئة. ألف-مكسيكي موجودة كما هو الحال في أشكال سطح المسكن العينين ومتعددة من السكان تعيش في كهف الأعمى التي لديها اختلافات مورفولوجية والسلوكية قوية. فقدان النوم حدث في متعددة، تطورت بشكل مستقل كافيفيش السكان. ويصف هذا البروتوكول منهجية للتحديد الكمي للنوم والنشاط الحركي في كهف مكسيكي (أ) وأسماك السطح. فيديو فعالة من حيث التكلفة نظام مراقبة يسمح لتصوير السلوكية من الأسماك اليرقات أو الكبار مساكن منفردة لمدة أسبوع أو أكثر. يمكن تطبيق النظام الصيد الذين تتراوح أعمارهم بين 4 أيام بعد الإخصاب من خلال مرحلة البلوغ. يمكن تكييفها مع النهج أيضا لقياس آثار التفاعلات الاجتماعية في النوم عن طريق تسجيل الأسماك متعددة في ساحة واحدة. وبعد التسجيلات السلوكية، يتم تحليل البيانات باستخدام الآلي تتبع البرامج وتحليل السكون هو معالجتها باستخدام البرامج النصية المخصصة التي قياس متغيرات النوم متعددة بما في ذلك مدة وطول نوبة ونوبة عدد. يمكن تطبيق هذا النظام لتدبير النوم والسلوك الإيقاعية والنشاط الحركي في تقريبا أي الأنواع السمكية بما في ذلك الزرد وستيكليباكس.
Introduction
النوم هو المحافظة عاليا في جميع أنحاء المملكة الحيوانية في المستويات الفسيولوجية والوظيفية والسلوكية1،،من23. في حين يتم تقييم النوم في الحيوانات المختبرية الثدييات عادة باستخدام اليكترونسيفالوجرامس، التسجيلات الكهربية عملية أقل في نظم نموذجية قابلة وراثيا صغيرة وهكذا يقاس استناداً إلى السلوك3 عادة النوم , 4-الخصائص السلوكية المرتبطة بالنوم هي المحافظة جداً في جميع أنحاء المملكة الحيوانية وتشمل زيادة الاستثارة العتبة، عكس مع التحفيز، والتتابع سلوكية مطول5. يمكن استخدام هذه الإجراءات لتوصيف النوم في الحيوانات التي تتراوح من الدودة السلكية، C. ايليجانس، عن طريق البشر6.
يتطلب استخدام التتابع السلوكية لتوصيف النوم برامج التتبع الآلي. مع تتبع البرامج، يتم تحديد فترات النشاط والجمود على مدى عدة أيام، وفترات طويلة من الخمول تصنف النوم7،8. في السنوات الأخيرة، وضعت عدة نظم التتبع للحصول على بيانات نشاط بين مجموعة متنوعة نظم نموذجية قابلة جينياً الصغيرة؛ بما في ذلك الديدان وذبابة الفاكهة والأسماك9،،من1011. وتقترن هذه البرامج بالبرمجيات التي تسمح للتتبع الآلي لسلوك الحيوانات، بما في ذلك مجانية المصدر المفتوح والبرمجيات المتاحة تجارياً7،،من1213،14 . هذه الأنظمة تختلف في مرونتها وتسمح بفحص كفاءة وتوصيف للنوم تعمل في العديد من النماذج تنظيمي وراثيا.
التحقيق الوراثي للنوم في الزرد، دانيو rerio، أدى إلى تحديد العديد من الجينات والدوائر العصبية التي تنظم النوم15،16. في حين أن هذا قد وفرت نظاما قويا للتحقيق على أساس العصبية للنوم في الحيوانات الفقارية مختبر، أقل بكثير معروفة حول كيفية تطور النوم وكيف الطبيعية يسهم الاختلاف النوم التنظيم. كافيفيش المكسيكية، أستياناكس مكسيكي (A. مكسيكي)، تطورت الاختلافات الهائلة في النوم والنشاط الحركي وايقاعات circadian17،18. وتوجد هذه الأسماك كما أيد الأسماك السطحية التي تعيش في الأنهار في جنوب تكساس والمكسيك ومالا يقل عن 29 الكهف السكان في جميع أرجاء منطقة سييرا ديل العبرة من شمال شرق المكسيك19،،من2021. بشكل ملحوظ، تظهر العديد من الفوارق السلوكية، بما في ذلك فقدان النوم، قد ظهر بشكل مستقل في عدة كافيفيش السكان14،22. ولذلك، توفر cavefish نموذجا للتحقيق في تطور متقاربة من النوم، الإيقاعية، والسلوكيات الاجتماعية.
ويصف هذا البروتوكول نظام لقياس النوم والسلوك الحركي في A. يرقات مكسيكي والكبار. نظام تسجيل مبنية على أساس الأشعة تحت الحمراء يسمح لتسجيل الفيديو من الحيوانات تحت ظروف الضوء والظلام. يمكن استخدام البرمجيات المتاحة تجارياً لقياس النشاط وتستخدم وحدات الماكرو المخصصة لقياس جوانب عدة من الخمول، وتحديد فترات للنوم. ويصف هذا البروتوكول أيضا التعديلات التجريبية لتعقب نشاط الحيوانات متعددة داخل خزان، وتوفير القدرة على دراسة التفاعلات بين النوم والسلوكيات الاجتماعية. يمكن تطبيق هذه النظم لتدبير النوم والسلوك الإيقاعية والنشاط الحركي في الأنواع السمكية إضافية بما في ذلك الزرد وستيكليباكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: إعداد نظم لتتبع السلوكية في اليرقات والكبار.
1-بناء نظام لنوم لليرقات
ملاحظة: ويتطلب نظام الرصد لتتبع اليرقات عن طريق الأسماك الأحداث الذين تتراوح أعمارهم بين 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) من خلال إدارة الشرطة الاتحادية 30 ألف مكسيكي الآلي أجزاء متعددة من المعدات بما في ذلك الأشعة تحت الحمراء (IR) الإضاءة، وضوء الناشرون اﻷكريليك الأشعة تحت الحمراء، الضوء عناصر التحكم (توقيت) وأجهزة الكمبيوتر والكاميرات والمواد الثانوية مثل الأسلاك ووحدات التحكم بالطاقة (الشكل 1A). وسيطلع الإرشادات التالية كيفية بناء نظام لتتبع بدقة السلوك الحركي لدراسة النوم وايقاعات circadian في اليرقات مكسيكي أ.
- بناء نظام إضاءة تتكون من الأشعة تحت الحمراء والضوء الأبيض التي تنبعث منها الثنائيات (الصمام): وضع ثلاثة مصابيح الأشعة تحت الحمراء في مثلث تقريبا 7.62 سم من بعضها البعض في غرفة تبريد منصة معدنية رقيقة 30.5 x 30.5 سم. سلك الأنوار في سلسلة بأسلاك كهربائية، والاتصال بمصدر طاقة.
- ضع ضوء أبيض واحد الصمام في وسط ثلاثة مصابيح الأشعة تحت الحمراء وإرفاقها بمصدر الطاقة.
- قم بتوصيل مصدر الطاقة للصمام بجهاز توقيت خفيفة لوقت الإيقاعية قياسية.
- بناء منصة لنظام تتبع اليرقات. استخدام سم 0.33 علامة بيضاء سميكة اﻷكريليك لجميع العناصر المكونة لمنهاج العمل.
- وضع منهاج تسجيل أعلى غرفة التبريد مربعة مضاءة في الساحات التي تحتوي على الأسماك تتواجد أثناء تعقب السلوكية.
-
مكان اكريليك ثانية داخل مربع بين الأضواء والحيوانات لنزع فتيل الأشعة تحت الحمراء للأمثل الإضاءة والتباين.
ملاحظة: أبعاد مربع الخفيفة اليرقات كما يلي: اثنان 18 × 8.5 سم وهما 17 سم × 8.5 سم المصابيح التي كيميائيا المستعبدين معا إلى النموذج 18 سم × 18 سم مربع هو 8.5 سم. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون اﻷكريليك بسهولة قطع أو حفر باستخدام الأدوات المناسبة لتعيين حجم مخصص.- وضع المرحلة تتبع اليرقات كاملة وإعداد الإضاءة داخل أنبوب بلاستيكي مغلق، وثم ضع الكاميرا على رأس الأنبوب.
ملاحظة: من المهم أن تبقى انعكاسات الإضاءة من الظهور في الفيديو التتبع، كهذا سيضر بدقة التعقب. ويحسن وضع الكاميرات على رأس أنبوب الذي يحيط بمنصة الإضاءة والحدة للكاميرات التي تستخدم لهذه التجارب.
- وضع المرحلة تتبع اليرقات كاملة وإعداد الإضاءة داخل أنبوب بلاستيكي مغلق، وثم ضع الكاميرا على رأس الأنبوب.
- التعامل مع كاميرا ويب (انظر الجدول للمواد) لتسجيل المستندة إلى الأشعة تحت الحمراء. إزالة العدسة الشركة المصنعة باستخدام أداة دوارة (انظر الجدول للمواد).
- إزالة مسامير فضية صغيرة على الأوجه الخلفية من الكاميرا لإزالة السكن الداخلي.
- إزالة مسامير سوداء صغيرة داخل جسم الكاميرا لتخفيف ما تبقى العدسة. استخدام مفك صغير لإزالة أي أجزاء من الإسكان العدسة التي تركت بعد قطع العدسة.
- إزالة قيادة الأزرق في الجزء العلوي من التهمة الموجهة إليه بالإضافة إلى الإسكان الجهاز (CCD).
- وضع الكاميرا مرة أخرى معا بوضع السكن الداخلي إلى اتجاه الأصلي الخاص به والشد اثنين المسامير الفضية مرة أخرى إلى موضعها الأصلي.
- وشهد الطريق داخل الكاميرا باستخدام صغيرة لتتناسب مع قليلاً توجيه بلاستيكية دائرية. السلس إلى أسفل البلاستيك إضافية حتى يمكن أن يصلح محول عدسة.
- قم بتثبيت عامل تصفية الأشعة تحت الحمراء-تمرير داخل الكاميرا قريبة من اتفاقية مكافحة التصحر قدر الإمكان دون إجراء اتصالات مباشرة مع الكاميرا.
ملاحظة: الحرص على عدم تلف رقاقة اتفاقية مكافحة التصحر ضمن الإسكان للكاميرا. يجب التأكد من الحفاظ على الخفض مستوى كما قدر الإمكان. ختم أي مساحة مفتوحة بين السطح الخارجي لتصفية الأشعة تحت الحمراء، وجسم الكاميرا لإبقاء الضوء من الوصول إلى اتفاقية مكافحة التصحر دون تصفيتها. - إرفاق الكاميرا بعدسة 35 ملم الثابتة (انظر الجدول للمواد) بالشد على محول الجزء الأمامي من الكاميرا في الجزء الخلفي العدسة.
- مكان الكاميرا والعدسة في الحفرة حفرت في الغطاء رأس الأنبوب الذي يضم المرحلة والأضواء وإرفاق USB بالكمبيوتر سيتم تسجيل الحيوانات من.
ملاحظة: ضع السمك في سلوك غرفة منفصلة حيث يتم إيواء تخزين الأسماك لضمان الحد الأدنى من الاضطرابات خلال التسجيلات السلوكية. العناية للحد من التقلبات في درجات الحرارة والتهوية التي يمكن الخلط بين التجارب السلوكية.
2-نظام النوم للكبار
- بناء نظام إضاءة الأشعة تحت الحمراء لتعقب الأسماك الكبار عن طريق قطع شرائط الأشعة تحت الحمراء إلى حوالي 46 سم الفواصل. واحد 46 سم قطاع غير كافية لكل صهريج السلوك 10 لتر.
- سلك كل قطاع معا في سلسلة، كل قطاع بأسلاك كهربائية DC لحام وإرفاق مصدر طاقة الخامس 9.
- إرفاق كل قطاع الأشعة تحت الحمراء إلى قطعة 51 سم x 5.1 سم من الألومنيوم التي ستكون بمثابة بالوعة الحرارة.
- ضع 46 سم × 5 سم، سم 0.32 سميكة 9% علامة مرور الضوء أبيض اكريليك ورقة مباشرة أمام كل قطاع ضوء الأشعة تحت الحمراء لنزع فتيل الأشعة تحت الحمراء الخفيفة.
- ضع جميع الدبابات على رف أن تدعم الإضاءة الخلفية التي شنت الأشعة تحت الحمراء.
- استخدام فواصل بلاستيكية غير شفافة في خزانات زجاجية ل 10 لإنشاء الساحات الفردية.
ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم الساحة على أساس عدد المقسمات المستخدمة وحجم الخزان. ويؤثر حجم الساحة النشاط الحركي والنوم في الكهف والأسماك السطحية23. - جبل الكاميرات تقريبا 4-6 متر من الدبابات. يمكن تسجيل كل كاميرا عادة من ثلاث دبابات في وقت لتوفير دقة كافية لتتبع.
ملاحظة: تسجيلات السلوكية الكبار عموما لا تتطلب نظام إضاءة أبيض منفصلة للتحكم في التغييرات نهاراً. ببساطة استخدام أضواء علوية القياسية في غرفة سلوكية متصلة بجهاز توقيت من المرجح أن تكون كافية.
3-تسجيل النشاط الحركي
ملاحظة: وتبذل جميع التسجيلات السلوكية استخدام الكمبيوتر المحمول القياسية أو سطح المكتب مع مصدر بطارية احتياطية. نظراً لحجم ملف كبير ح 24 تسجيل (60-100 غيغابايت)، حفظ جميع التسجيلات على محركات الأقراص الصلبة الخارجية.
- تأقلم الأسماك تتراوح أعمارهم 4-30 إدارة الشرطة الاتحادية ح 18-24 قبل الشروع في التسجيلات. تغذية اليرقات السمكية مع حية الماء المالح الجمبري عندما وضعت أولاً في دائرة التسجيل، وح 1 قبل بداية التسجيل. تأقلم الأسماك الكبار 4-5 أيام قبل تسجيل السلوك وتغذية مرة واحدة يوميا مع الطعام فليك أو بلاكوورمس العيش.
ملاحظة: تأكد من وضع اليرقات السمكية في المياه العذبة قبل التسجيل، كما سيؤدي بقايا الماء المالح الروبيان تتبع القضايا أثناء تحليلها في وقت لاحق. استزراع يشترك مع الروتيفر يوفر خيار بديل، كما أن صغر حجمها لا تتداخل مع تتبع. - مكان الأسماك الذين تتراوح أعمارهم بين 4-6 إدارة الشرطة الاتحادية في لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا. بيت الأسماك الذين تتراوح أعمارهم بين 20-30 إدارة الشرطة الاتحادية في زراعة الأنسجة 12-جيدا لوحات تسجيل.
- سجل الكبار في خزانات ل 10 تناسب مع فواصل لاستيعاب الأسماك خمسة مساكن منفردة، أو بدون فواصل لسجل النوم والنشاط في إعداد اجتماعية.
ملاحظة: الحرص على تركيز الكاميرا قبل الشروع في التسجيل من أجل تحقيق أقصى قدر من الدقة التعقب. لا تقم بفتح القزحية عدسة الكاميرا بعيداً جداً، كما جذريا وهذا سوف يقلل من حدة الصورة. وهناك توازن، ومع ذلك؛ إذا تم إغلاق القزحية بعيداً جداً، وسوف تقل معدل الإطارات للفيديو 15.00 fps. من الضروري لتحليلها في وقت لاحق أن معدل الإطار لا يزال 15.00 أطر لكل ثانية للاستخدام مع بعض23،برنامج نصي مخصص مكتوب النوم24. - تعيين الإضاءة/السطوع اضاءات خلفية.
- تحسين الإضاءة قبل بدء التسجيل. دائماً الاحتفاظ التباين على أعلى مستوى ممكن، واستخدام السطوع و الإضاءة الخلفية لضبط السطوع حتى الحيوانات الأكثر واضحة.
- سجل الأسماك 24 أو 48 ساعة.
ملاحظة: ينبغي شراء حزم بطارية احتياطية طارئة أن قوة جميع الإضاءة وأجهزة الكمبيوتر، والكاميرات في حالة انقطاع التيار الكهربائي. جميع حزم البطارية يجب أيضا توصيل منافذ الطاقة في حالات الطوارئ، إذا كان ذلك ممكناً. حزم البطارية لن عموما السلطة المعدات لأكثر من بضع دقائق إلى ساعة على الأكثر، وتعمل على جسر يربط بين فقدان الطاقة الرئيسي ونقلها إلى نظام الطاقة في حالات الطوارئ.
4-تحليل "النشاط الحركي" في "فردي مساكن الأسماك استخدام الآلي" تتبع البرمجيات
- للبدء في تحليل السلوك، فتح تتبع البرامج، حدد التجربة الجديدة من القالب، ثم حدد تطبيق "قالب بريديفينيد".
- كما سوف يطلب البرنامج الآن ما هي الأنواع المسار، حدد الأسماك. استخدم مربع القائمة المنسدلة لتحديد أما اليرقات الزرد الزرد الكبار اعتماداً نموذج تجريبي.
- قم بإعداد الساحات التي سوف تتبع كل الحيوانات. بالنسبة لليرقات، حدد أيضا لوحة وجولة جيدا و لا منطقة قالب. للبالغين، استخدم حقل مفتوح، وساحة مع قالب منطقة لا. ثم تحديد عدد مناسب من الساحات، واحدة لكل الحيوانات التي يتم تعقبها في الفيديو.
- حدد النموذج لتعقب الأمثل، انقر فوق تتبع نقطة مركز ، ، وتأكد من أن يتم تحديد لون الحيوان ليكون أغمق من الخلفية. تطبيق معدل الإطارات التي تم اقتناؤها الفيديو. وينبغي أن تتبع البرمجيات تلقائياً الكشف عن هذا.
- رسم مقياس لمعايرة المسافة العالم الحقيقي للكائن لتحديد دقة السلوك الحركي للأسماك باستخدام إعدادات الساحة.
- تحرير الساحات للتأكد من أنه سيتم تعقب المنطقة بأكملها أن الأسماك؛ وإلا ستفقد أثناء اقتناء العينات.
ملاحظة: توخ الحذر عند إعداد المناطق. الأسماك اليرقات حساسة خاصة لتعقب أخطاء إذا كانت الساحات أما كبيرة جداً أو صغيرة. كما يمكنك إنشاء الإضاءة سيئة في التجربة الظلال على الجدران لوحات جيدا، والتي أعتقد البرنامج قد يكون حيوان، خلق إيجابية كاذبة. - انقر فوق متقدم. في إطار الأسلوب في الكشف عن الإعداد، حدد الطرح الحيوي، ثم انقر فوق الخلفية وحدد بدء التعلم. ضبط نسبة إشارة/الضوضاء على النقيض المظلم حتى يتم تعقب الحيوانات جيدا، ولا يسبب الخلفية تتبع للقفز.
ملاحظة: يمكن أن تختلف جودة الفيديو بين التجارب، حيث أن كل محاكمة قد تحتاج إلى استخدام إعدادات مختلفة، تبعاً لذلك. استخدام ميزات كفاف الموضوع و حجم هذا الموضوع يمكن أن تحسن إلى حد كبير تتبع النتائج. - حدد قائمة المحاكمة وتحميل المعلمات الصحيحة قبل البدء في تسجيل البيانات في البرنامج.
- انقر فوق في علامة التبويب اقتناء وحدد المسار المخطط جميع المحاكمات وانقر فوق الزر السجل.
- إطار تحليل الشخصية، تأكد من تحديد المسافة والوقت والحركة .
ملاحظة: من أجل تحليلها النوم في وقت لاحق، من الأهمية بمكان أن هذه الإعدادات بشكل صحيح، يجب قراءة ملف .perl هذه البيانات بالترتيب الصحيح لحساب النوم. - وفي إطار تصدير، حدد البيانات الخام، تصدير البيانات كنص Unicode.
5-تتبع اجتماعيا يضم الأسماك
- اتبع الخطوات 4.1-4.4 إعداد هذه التجربة في تتبع البرمجيات.
- في القائمة المنسدلة، حدد كم عدد الحيوانات لتعقب للتجربة.
- في إعدادات الساحة ، رسم الجدول الصحيح لمعايرة المسافة في العالم الحقيقي.
- في الكشف عن الإعدادات، استخدم الطرح الحيوي، وضبط التباين الظلام لتعقب أفضل الحيوان.
- ضبط حجم الموضوع تحت إعدادات الكشف، بحيث يتم تعقب إلا جزء صغير جداً من الحيوان.
ملاحظة: من خلال تتبع سوى جزء صغير من الحيوان، هذا سوف يقلل من الكمية من التبديل بين الحيوانات عند عبورهم المسارات أثناء اقتناء. - حالما يتم الحصول على المسارات، استخدم محرر المسار يدوياً تحديد مرات حيث الأسماك قد عبر مسارات.
6-استخراج البيانات النوم من النشاط الحركي
ملاحظة: تعريف السلوكية للنوم في اليرقات والكبار على حد سواء مكسيكي (أ) هو 1 دقيقة أو أكثر من الهدوء. كان يحدد هذا التعريف باستخدام تجارب عتبة الاستثارة، حيث حافز حسي أكبر مطلوب لبدء استجابة سلوكية في حالة نوم (> 60 s) مقارنة بالاستيقاظ14،17. على حساب الحركات الصغيرة والانجراف الشائعة الأنواع، هناك يتم تطبيق عتبات السرعة فصل حركة حقيقية من الضوضاء أو الانجراف. هذه العتبات اشتقاق حسابياً عن طريق مقارنة الارتباطات بين المسافة ومدة النوم البحث عن قيم التربيعي أعلى؛ وبالتالي تحديد السرعة الأكثر دقة للحركة والسكون. للأسماك اليرقات والحدود العليا والسفلي معا 12 مم/s كما أن هناك قليلاً للا الانجراف. للأسماك الكبار الحد الأدنى 2 سم/ثانية مع حد أعلى 4 سم/s لحساب الانجراف.
- تثبيت Cygwin لتحليل الكمبيوتر للقيام بتنفيذ البرامج النصية المكتوبة بمخصص لاستخراج الحركي والسلوك من النوم.
- قم بإنشاء مجلد تجربة جديدة داخل الدليل الرئيسي Cygwin.
- استيراد بيانات Unicode الخام من تتبع البرامج وتنفيذ الملف.sh في Cygwin لتحويل الترميز من UTF-16 إلى utf-8.
- تنفيذ ملف.perl في Cygwin لاستخراج البيانات النوم.
- فتح ملف الماكرو واتبع الإرشادات التي تظهر في جدول البيانات وضع الصيغة النهائية لتحليل البيانات كما هو مطلوب.
ملاحظة: مستوى أساسي من الترميز سطر الأوامر سيكون من الضروري القيام بهذا الجزء من التحليل. أوامر لينكس العامة تكفي. إذا كانت هناك مشكلات مع برامج قراءة البيانات بشكل صحيح، تحقق من البيانات من تتبع البرمجيات في أي محرر نص متاحة بحرية للتأكد الترميز والترتيب الصحيح للملفات التنفيذية الكتابة بشكل صحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يرقات الإعمار 4-30 إدارة الشرطة الاتحادية يمكن أن تسجل موثوق في نظام مغلق مخصص-البناء المبين في الشكل 1. ويشمل النظام بالأشعة تحت الحمراء والإضاءة واضحة للسماح بالحصول على تسجيلات تحت ظروف الضوء والظلام، تحت مختلف ظروف الإضاءة المرئية (الشكل 1A). أشرطة الفيديو ثم تحليلها باستخدام برامج التتبع (الشكل 1، ج) وبعد معالجتها باستخدام ماكرو نوم مخصصة (انظر تحميل إضافي). عرض الأسماك اليرقات من ثلاثة كافيفيش المستقلة السكان انخفاضا كبيرا في النوم مقارنة بالأسماك السطحية (الشكل 1) و 20 إدارة الشرطة الاتحادية، ويتسق هذا فقدان النوم عبر مراحل النمو. عصر الأسماك التي تم تحليلها للنوم في كثير من الأحيان تعتمد على التلاعب بالتجريبية. على سبيل المثال، مكسيكي (أ) لا تستهلك الغذاء في 4 أيام، حيث التجارب دراسة التفاعلات بين النوم والتغذية سوف تحدث عادة في كبار السن اليرقات25. على العكس من ذلك، مورفولينوس لا تكون فعالة إلا في أوائل جمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية (عادة أصغر سنا من إدارة الشرطة الاتحادية 4) حيث يتم استخدام هذا العمر إلى تقويم النوم24،،من2627.
مكسيكي (أ) يمكن أن يعيش لمدة تصل إلى 30 عاماً في المختبر، ولكن تجري تجارب باستخدام البالغين عادة في الأسماك الذين تتراوح أعمارهم بين 6 أشهر و 3 سنوات. الأسماك يمكن أن تسجل في مجموعة متنوعة من أحجام دبابة اعتماداً على التجربة وإضاءة الأشعة تحت الحمراء يسمح للتسجيلات خلال فترات الضوء والظلام (الشكل 2A). تتم تسمية الساحات الفردية في تتبع للسماح بتتبع الأسماك، ومرحلة ما بعد المعالجة باستخدام ماكرو مخصص يوفر قراءات نوم (الشكل 2، ج). النوم هو إلى حد كبير في كافيفيش Pachón و Molino تنجا، مقارنة بأسماك السطح (الشكل 2D). وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا النظام لتسجيل الأسماك متعددة في ساحة واحدة (عادة 10 غالون الدبابات)، مما يسمح لتحليل التفاعلات الاجتماعية كيف تؤثر على النوم (الشكل 2Eوو). المساكن الاجتماعية قوة يقلل من النوم في الأسماك السطحية، دون التأثير على النوم في Pachón كافيفيش (الشكل 2). عدم وجود تأثير في كافيفيش احتمالاً بسبب تأثير الطابق السفلي، حيث كافيفيش النوم قليلاً، لا سيما في الساحات الكبيرة المستخدمة لدراسة السلوك الاجتماعي.
الشكل 1: تسجيل سلوك النوم في اليرقات والأحداث مكسيكي أ. التخطيطي (A) من إعداد سلوك النوم اليرقات: اليرقة يتم وضعها على منصة داخل أنبوب تسيطر عليها الضوء. نظم إضاءة الأشعة تحت الحمراء والبيضاء الجلوس أدناه الأسماك في الجزء السفلي من الأنبوب. كاميرا الأشعة تحت الحمراء-تمرير يجلس في الجزء العلوي من الأنبوب ومتصل بجهاز كمبيوتر محمول الذي يتم تسجيل الفيديو. جميع أنظمة الطاقة (الإضاءة وأجهزة الكمبيوتر المحمول) موصولة إلى قوة احتياطية. (ب) إعدادات الساحة في تتبع البرامج. يرقات الفردية يتم الاحتفاظ في الآبار في صفيحة زراعة الأنسجة، والساحات (السماوي) لكل الحيوانات. (ج) آثار الحركي للسلوك الحركي الأسماك بعد الحصول على البيانات في تتبع البرامج. آثار حمراء تمثل 10 s من النشاط في الأسماك 20-يوم القديمة. (د) الناتجة النوم البيانات من تتبع البرامج. كافيفيش الأحداث تتلاقى عند النوم انخفاض السلوك نقراً الأسماك السطحية بالمقارنة مع (One-way ANOVA F(3, 116) = 76.12؛ تم تطبيق تحليل الوظائف المخصصة Dunnett مقارنة كل السكان cavefish مع سطح الأسماك، ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الكبار مكسيكي (أ) نظام للنوم والسلوك الإيقاعية. (أ) رسم تخطيطي لنظام تسجيل النوم: تعقد الأسماك في خزانات على رف مقابل لتتبع الكاميرات. يتم وضع نظام إضاءة الأشعة تحت حمراء وراء الدبابات الأسماك، بينما يتم إرفاق كاميرات الأشعة تحت الحمراء-تمرير إلى جهاز كمبيوتر محمول لتسجيل السلوك. جميع أنظمة الطاقة موصولة إلى نظام بطارية احتياطية في حالة حدوث تقلبات الطاقة. (ب) الساحة الإعداد في تتبع البرامج. الأسماك الفردية تتسم بإنشاء ساحات منفصلة (السماوي) لتعقب السلوك الحركي. (ج) ممثل الحركي المسارات (خطوط حمراء) من الأسماك الفردية بعد الحصول على تسجيل سلوكية على تتبع البرامج. آثار تمثل 20 ثانية من النشاط. (د) مدة النوم الإجمالية أكثر من 24 ساعة انخفض انخفاضا كبيرا في السكان متميزة ثلاثة من كافيفيش الأسماك السطحية بالمقارنة مع (One-way ANOVA F(3, 106) = 52.66؛ تم تطبيق اختبارات الوظيفة المخصصة دونيت بين الأسماك السطحية وكل سكان الكهوف، ف < 0.001). (ﻫ) دبابة واحدة تحتوي على الأسماك المتعددة التي يقدم فيها الساحة واحد (برتقالي) لتعقب التفاعلات الاجتماعية والنوم. (و) آثار الحركي للأسماك متعددة بعد الحصول على البيانات في تتبع البرمجيات (يمثل كل لون الخط أسماك فردية). (ز) بيانات ممثلة السطحية وكافيفيش Pachón في النوم اجتماعية تتبع. الأسماك السطحية خفض كبير النوم في خزانات 10 لتر بالمقارنة إلى ساحات ل 2؛ كذلك ينخفض النوم الأسماك السطحية عند الأسماك يسكن اجتماعيا. لا يتم تبديل النوم كافيفيش إلى حد كبير في أي حالة (F(2,46) ANOVA المزدوج = 4.545؛ أجرى التحليل بعد المخصصة داخل كل السكان لاختبار تأثير حجم الخزان والدولة الاجتماعية على النوم مجموع 10 لتر واحد، ف = 0.013؛ 10 "ل الاجتماعي"، ف = 0.0003). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول نظام مخصص للتحديد الكمي للنوم والنشاط الحركي في cavefish اليرقات والكبار. كافيفيش ظهرت كنموذج رائد لدراسة تطور النوم التي يمكن استخدامها للتحقيق أساسا الوراثية والعصبية من النوم البند1. وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول الأمثل للإضاءة وجوده الفيديو لضمان دقة التعقب التي ضرورية لتحديد وضع السكون. نظام اقتناء وتحليل ووصف هنا تعمل بكامل طاقتها، وكذلك العديد من النظم الأخرى، على حد سواء التجارية والمواصفات، تحديد حجم الحركة والسلوك28،،من2930. ويمكن تمديد المقايسة السابقة دراسة النوم في واحدة من الأسماك السماح بتحليل لإيواء مجموعة الأسماك. اعتبار هام عند حل المشاكل أو تصميم فحوصات يفند السلوك الاجتماعي قد يكون على النوم للفرد. على سبيل المثال، العدوان أمر شائع في أستياناكس، وتختلف مستويات العدوان بين الأسماك السطحية و cavefish31. تحسين عدد الأسماك، وحجم من الساحة، ونسبة الجنس، بغية التقليل إلى أدنى حد العدوان سيسمح لقياسات استنساخه لتنظيم النوم.
وجود قيود على هذا الأسلوب، كما هو موضح، الافتقار إلى الموثوقية بعد الأسماك الفردية في جميع أنحاء المقايسة. غالباً ما تتبع الحيوانات الآلي سيتبدل الحيوانات عندما يأتون إلى اتصال وثيق. يمكن معالجة هذا التحسين حذراً من العتبات، أو يدوياً تصحيح أية رموز تبديل. وبالإضافة إلى ذلك، النظام المذكور ليس نظاما من خلال التدفق، وذلك، نوعية المياه يمكن أن تصبح مشكلة بعد التسجيلات التي تدوم أكثر من بضعة أيام. وقد وصف تدفق الأخرى من خلال نظم في الزرد13 وهذه يمكن تطبيقها سهولة إلى مكان قذر كافيفيش المكسيكية.
المنهجية الموصوفة كبيرة بسبب انطباق واسع لقياس السلوك في أنواع الأسماك المختلفة. ولم توصف في أسماك المياه البحرية الطازجة أو تقريبا أي بما في ذلك ستيكليباكس والبلطي سووردتايلس32،،من3334النوم. براعة في هذا النظام لقياس النوم في ألف مكسيكي ونماذج أخرى من الأسماك قد تناول أسئلة متنوعة حول تطور والأسس الوراثية للنوم. الأجهزة المرتبطة بهذا النظام التكلفة العالية، مما يجعل من إمكانية الوصول للغاية وتوفير تحليل الإنتاجية العالية الدوائية وتحليل اكوتوكسيلوجيكال للنوم والنشاط الحركي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لديهم لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيده هذا العمل جائزة NIGMS GM127872 ACK، وجائزة NINDS 105072 للشعبة و ACK، وجبهة الخلاص الوطني جائزة 1656574 إلى ack.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
References
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J.
- Allada, R., Siegel, J. M.
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B.
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, Oxford University Press. Available from: http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1 (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
