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方法文章

利用低氧/SU5416模型在小鼠中诱导和表征肺动脉高压

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DOI：

10.3791/59252

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2020年6月3日

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Phospholamban Foundation

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于低氧暴露并联合注射血管内皮生长因子（VEGF）受体拮抗剂来诱导小鼠肺动脉高压（PH）的方法。动物在启动方案后3周内发展出肺动脉高压及右心室（RV）肥厚。本文还介绍了该模型的功能学和形态计量学特征表征。

摘要

肺动脉高压（PH）是一种病理生理状态，其定义为在静息状态下经右心 导管术测得的平均肺动脉压超过25 mm Hg。多种疾病均可导致PH，这些疾病在病因、组织病理学、临床表现、预后及对 治疗的反应方面各不相同。尽管近年来已取得显著进展，PH仍是一种尚未被治愈的疾病。深入理解其潜在机制有助于开发新的治疗方法。动物模型是实现这一目标的重要研究工具。目前已有多种可用于模拟PH的模型。本实验方案描述了一种双打击小鼠PH模型，通过低氧暴露联合注射SU5416（一种血管内皮生长因子（VEGF）受体拮抗剂）作为诱导PH的刺激因素。在启动低氧/SU5416处理3周后，动物会出现肺血管重构，模拟人类PH（主要为第1组）中观察到的组织病理学改变。肺循环中的血管重构进一步导致右 心室（RV）的重构。本文详细描述了右心室压力测量（采用开胸法）、右心室形态计量学分析（通过分离并称量两个心室）以及重构的组织学评估方法（肺部方面评估血管重构，心脏方面评估右心室心肌细胞肥大和纤维化）。该方案的优势在于既可用于野生型小鼠，也可用于基因修饰小鼠，实施相对简便且成本较低，并可在较短时间内（3周）快速建立目标疾病模型。该方法的局限性在于小鼠通常不发展为严重表型，且在恢复常氧后PH可逆。此外，该模型易于开展预防性和治疗性研究，无需掌握高难度的外科操作技能（与手术类啮齿动物模型相比）。

引言

肺动脉高压（PH）是一种病理生理状态，其定义为在静息状态下通过右心导管检查测得的平均肺动脉（PA）压超过25 mm Hg1,2。多种疾病均可导致PH的发生。为了对与PH相关的疾病进行系统归类，已提出了多种分类体系。目前的临床分类将与PH相关的多种疾病分为5个不同组别1。这种区分具有重要意义，因为不同组别的患者在临床表现、病理特征、预后以及对治疗的反应方面均存在差异2。表1总结了当前的分类体系，并补充了每种疾病的基本组织病理学特征。

肺动脉高压表格；组织病理学特征、动物模型、肺部疾病类型。
表 1：肺动脉高压（PH）临床分类的概述，以及各组内的主要组织病理学特征。缺氧/SU5416 方案用于建立肺动脉高压模型的适用性。本表格改编自19。PH：肺动脉高压，PAH：肺动脉型肺动脉高压

尽管与肺动脉高压（PH）相关疾病的治疗已取得显著进展，但PH仍无法治愈，其3年死亡率在20%至80%之间3。这表明迫切需要深入理解PH的潜在发病机制，并在此基础上开发新型疗法，以预防疾病发生、延缓病情进展并最终实现治愈。动物模型在实现这一目标中具有至关重要的作用。目前已有多种可用于研究PH的动物模型。感兴趣的读者可参考该领域出色的综述文章2,3,4。考虑到导致PH的疾病种类多样，显然无法通过单一动物模型完美再现人类PH的各种复杂情况。现有的动物模型可分为以下四类：i）单次打击模型，ii）双重打击模型，iii）基因敲除模型，以及iv）基因过表达模型3。在单次打击模型中，PH由单一病理刺激诱导；而双重打击模型则结合两种病理刺激，旨在诱导更严重的PH表型，从而更接近人类复杂的疾病状态。除了病因学上的差异外，不同刺激所建立的PH模型还因动物物种及其遗传背景的不同而存在建模差异4。

最常用的经典肺动脉高压（PH）啮齿类动物模型之一是慢性缺氧模型2。已知缺氧可在人类以及多种动物物种中诱导PH的发生。缺氧的优势在于其是一种生理性的PH刺激因素（表1）。然而，尽管用于啮齿类动物诱导PH的缺氧程度远比人类严重，但单一的损伤因素（缺氧）仅导致轻度的血管重构，无法模拟人类疾病的严重程度。引入第二次打击（second-hit），即增加额外的PH诱导刺激，已显示出良好的效果：将化合物SU5416注射至啮齿类动物并联合缺氧刺激，可诱导出更严重的PH表型2,5,6。SU5416是一种血管内皮生长因子（VEGF）受体-2抑制剂，可阻断VEGF受体，导致内皮细胞发生凋亡。在缺氧条件下，这会刺激一部分抗凋亡内皮细胞增殖。此外，SU5416还可引起平滑肌细胞增殖。这些效应的综合作用导致肺循环发生病理性血管重构，进而引起肺动脉（PA）压力升高及右心室重构2,5,7。该模型最初在大鼠中建立6，随后被应用于小鼠4,5,7。与大鼠相比，小鼠模型的血管重构程度较轻。此外，当恢复至常氧环境后，大鼠的PH会持续进展，而在小鼠中则部分可逆。

以下方案详细描述了使用低氧/SU5416方法建立小鼠肺动脉高压（PH）模型的全部步骤（包括规划、时间安排和操作流程）。此外，本方案还描述了对该模型的表征方法：功能学方面（通过开胸技术有创测量右心室（RV）压力），形态计量学方面（通过分离并称量右心室和左心室），以及组织学方面（评估肺血管重构、右心室心肌细胞肥大和纤维化）。

本方案中描述的所有步骤和方法均可由任何经验水平的研究人员轻松实施。尽管采用开胸技术（此处所述）对右心室进行功能测量并非该领域的金标准方法，但其优势在于即使是经验较少的实验人员也能快速掌握并准确重复。

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方案

在进行任何动物实验之前，须获得当地机构动物护理委员会的授权。本实验是在西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行的。

1. 肺动脉高压（PH）诱导

  1. 准备
    1. 在开始研究之前，仔细规划实验设计。确保小鼠在第一次注射 SU5416 的同时开始暴露于低氧环境。使用低氧/SU5416 方法诱导肺动脉高压（PH）的实验设计示例如 图1A 所示。对照组小鼠仅接受溶剂处理。在此模型中，SU5416 将每周注射一次，连续注射3周。
    2. 本研究使用8至12周龄的C57BL/6小鼠。将动物饲养在18–20 °C、12小时光照-黑暗循环的环境中。确保食物和水自由获取（ad libitum）。
    3. 称量动物体重，并随机分配至各组：常氧组和低氧/SU5416组。
    4. 按照 图1B 所示准备低氧舱。将氮气（N2）钢瓶置于舱体附近。将氧气（O2） 控制器设定为10% O2，并让系统达到稳态。
    5. 准备用于注射的 SU5416（使用剂量为20 mg/kg 体重）。SU5416 不溶于水溶液，因此需将计算量的药物溶解于100 μL DMSO8中。例如，对于一只25 g的小鼠，应注射0.5 mg SU5416，溶于100 μL 溶剂（DMSO）中。因此，该小鼠的 SU5416 最终浓度为5 mg/mL。
      警告：SU5416 为危险物质。请仔细阅读产品附带的安全数据表，并在操作该物质时采取推荐的防护措施。佩戴防护手套，并（如同任何注射操作一样）使用眼部保护装置。图1C 展示了 SU5416 的化学结构。
      注意：应计算适量的额外溶液，以补偿注射过程中可能损失的体积（如注射器、小瓶等中的残留）。根据所用注射器的不同，死体积约为200 μL。对于10只小鼠的实验组，建议额外准备相当于2只小鼠剂量的溶液。
    6. 准备用于注射的注射器。使用1 mL 注射器配25 G × 5/8” 针头。
  2. SU5416 皮下注射
    1. 固定动物。将小鼠放置在笼盖上以协助固定。抓住背部皮肤并形成与脊柱平行的皮褶。务必牢固抓住头部后方皮肤，以防小鼠咬伤。
      注意：两名研究人员配合操作可使过程更快速、准确，一人固定动物，另一人进行注射。
    2. 将针头插入侧腹部皮肤松弛处的皮下组织。确保针头与皮肤表面平行插入，避免穿透腹壁。
    3. 注射注射器内容物（100 μL 溶解的 SU5416 或溶剂）。
      注意：为防止注射完成后药液渗漏，可在注射结束后保持注射器停留约10秒，并在皮下轻微旋转针头。
    4. 拔出针头并将动物放回笼中。在完成 SU5416 注射后，将笼子放入通风的低氧舱内。
  3. 低氧暴露
    1. 持续监测通风情况，确保维持10%的氧气供应。将常氧组动物置于可部分密封的舱内，维持21% O2环境。
    2. 确保舱内配备氧气传感器以实时监测氧浓度。避免频繁或长时间打开舱体。清洁及补充食物和水时，每3天开舱时间不得超过20分钟。
    3. 每日检查动物状态，关注应激信号，如毛发竖立或显著体重下降。
      注意：接受低氧/SU5416处理的小鼠预期会出现体重下降5，这是疾病发展的表现之一。
    4. 每周重复注射 SU5416，连续3周（实验设计概览见 图1A）。
      注意：更换注射部位有助于减少皮肤刺激。

2. 通过侵入性右心室压力测量进行功能表征

  1. 准备
    注意：选择一种麻醉方案。可使用注射或吸入麻醉剂。由于注射麻醉剂（尤其是氯胺酮/赛拉嗪或戊巴比妥钠）轻微过量即可显著影响心脏功能，因此建议使用挥发性 建议使用麻醉剂。在同项研究中，所有小鼠应使用相同的麻醉剂。
    1. 使用麻醉蒸发器以确保每只动物接受准确的麻醉剂剂量。异氟烷的剂量如下：诱导麻醉3-4%，维持麻醉1%与100%氧气混合。
      注意：穿戴个人防护装备，避免吸入蒸气。
    2. 准备加热垫和/或保温灯以维持体温。准备直肠温度探针用于监测体温。
    3. 确保通风良好。提前准备好呼吸机。准备好Y型管连接器，并使用手动模式检查呼吸机功能。确保吸气压 <1 cm H₂O2以避免气压伤。将呼吸频率设置为110次/分钟。
    4. 通过剪切一根20 G血管内导管来制备气管插管。
    5. 准备所需器械：小镊子、剪刀、弹性钩状牵开器、血管电凝器和棉签。取一根25 G × 5/8英寸的细针，固定在棉签上，用于在右心室进行小孔穿刺。
    6. 准备压力导管、压力-容积控制单元，并启动数据采集软件。将PV导管置于15 mL 充满 PBS 的试管，37 ℃ °C 反应 15 分钟，并根据制造商的说明书进行校准。
    7. 为器官灌注和固定，准备磷酸盐缓冲液（PBS）以及50% PBS / 50% OCT的混合溶液。准备两支10 mL注射器（配备25 G针头）：其中一支用于以PBS灌注心脏和肺组织 原位 以及第二个 用于向将用于组织学检查的肺组织标本注射OCT/PBS（50/50）溶液。
  2. 插管
    1. 称量小鼠体重并记录麻醉前的健康状况。
    2. 使用3-4%异氟烷诱导麻醉。通过足趾夹捏反射检测麻醉深度：用力夹捏一个肢体的足趾。如果动物出现肢体回缩，则表明麻醉深度不足。
    3. 麻醉诱导后，剃除颈部和胸部区域的毛发。
    4. 将小鼠置于加热垫上，插入直肠温度探头以监测体温。
      注意：在功能测量过程中，维持体温至关重要。体温应保持在约 36.5–37 ℃。 °C.
    5. 使用弯头镊子将缝合线固定在小鼠的上切牙上，拉紧后用手术胶带固定于加热垫上。用手术胶带固定小鼠的四肢。
    6. 使用小剪刀在颈部中线皮肤处做一个约1 cm的小切口，以便对动物进行插管。
      注意：经口插管是一种替代方法，需要更多操作经验。
    7. 用棉签钝性分离中段的腮腺和下颌下腺。这将暴露覆盖在气管上方的肌肉。
    8. 仔细剪开这些肌肉以暴露气管。
    9. 用小剪刀在气管软骨之间做一个小切口，插入准备好的气管插管。取出血管内导管的金属导丝。
    10. 将导管连接至呼吸机。通过手动轻柔地充气膨胀肺部来确认气管插管的位置。用胶带固定位置。
    11. 在整个操作过程中维持1%异氟烷麻醉。
    12. 通过测试脚趾夹捏反射定期监测麻醉深度，并相应调整麻醉状态。
      注意：在1%异氟烷麻醉下进行实验时，推荐的心率约为400次/分钟。维持体温和麻醉状态对于控制心率至关重要。异氟烷过量可导致心率下降，但通过降低异氟烷流速可实现恢复。
  3. 右心室压力测量（开胸法）
    1. 使用小剪刀在剑突及上腹部区域进行约1厘米的皮肤切口。分离覆盖胸部和上腹部象限腹壁的皮肤：从剑突远端的中线开始，仔细向两侧横向分离。使用电热止血法控制出血。
      注意：目标是通过腹壁进入胸腔。
    2. 打开腹腔并小心剪开膈肌，注意不要损伤跳动的心脏或肺组织。
      注意：目标是暴露心脏的心尖和右心室。良好的心脏暴露和视野对于导管的准确定位至关重要。整个操作过程中必须避免出血，因为血管内体积的微小变化都可能改变右心的负荷，从而影响所记录的参数。
    3. 使用棉签轻轻去除心包膜。
    4. 将压力导管置入心脏前，先将导管移至小鼠附近。
    5. 使用预先准备好的带针棉签在右心室心尖远端部位刺出一个穿刺伤口。小心取出针头，将压力导管插入该孔中。
      注意：此操作应在不施加外力的情况下完成。如果无法实现，可尝试在第一个孔附近重新打一个新孔。 以避免对心脏造成过度损伤。针头插入深度不应超过约3 mm。
    6. 将压力导管平行于右心室方向插入，导管尖端朝向肺动脉。
    7. 观察压力波形以确保导管位置正确。代表性波形如图所示。 图2.
    8. 让压力信号稳定。暂停呼吸，至少获取3次测量值。每次测量之间允许动物进行通气。
    9. 记录完所有测量数据后，移除导管并将其放置 返回 PBS填充的 水浴中的试管
      注意：在 实验完成后，根据制造商的说明清洁导管。
  4. 安乐死与肺灌注
    1. 实验结束后，通过放血法处死小鼠。
    2. 广泛打开胸腔。使用 剪刀剪开整个胸骨，注意不要损伤心脏或肺。
    3. 使用虹膜剪在左心室上做一小切口，以允许血液流出心室。
    4. 将装有10 mL PBS的注射器上的25 G针头插入右心室，并注入PBS溶液，直至肺部血液完全清除。
    5. 此步骤完成后，通过重要组织（心脏和肺）的采集确认安乐死：切断腔静脉和主动脉连接，取出心脏和肺 整块.

3. 形态计量学表征

  1. 在取出心脏和肺脏后（步骤 2.4.5），立即分离心脏并去除两个心房。使用弯头肌腱剪小心地将右心室（RV）与左心室（LV）分离，室间隔（S）保留在左心室一侧。分别称量右心室和左心室加室间隔（LV+S）的重量，并计算富尔顿指数 = RV / (LV + S)图3)5,9.
  2. 取一部分右心室 并将其放入已预装OCT的包埋模具中。将右心室的另一部分用于RNA和/或蛋白质分析。用干冰速冻后于-80℃保存。 °C.
  3. 使用虹膜剪将肺脏从心脏及其他残留组织中分离出来。
    注意：肺组织制备时，上述灌注步骤（2.4.3–2.4.5）至关重要。
  4. 将部分肺组织速冻，用于后续RNA、蛋白质提取或其他检测，并妥善保存。
  5. 将肺部的另一部分用于组织学分析。为此，将装有50% PBS和50% OCT的注射器插入已使用肺叶的支气管中10,11实验者可以清楚观察到，当注射器中的液体灌注到组织中时，肺部会膨胀。
  6. 将肺组织块放入预先装有OCT的包埋模具中，并在干冰上快速冷冻。将样品储存于-80℃ °C，待其冷冻后。
  7. 准备8 μ使用冷冻切片机对右心室和肺组织进行冰冻切片。室温下干燥切片30分钟。
  8. 使用10%多聚甲醛（PFA）在室温下固定载玻片10分钟。
    注意：PFA 是一种已知的人类致癌物。应使用化学通风橱、规范操作流程和个人防护装备以降低暴露风险。更多信息请参阅材料安全数据表（MSDS）。
  9. 苏木精/伊红染色法评估血管重塑
    注意：进行苏木精/伊红染色以评估心脏的结构变化 肺部血管重塑（图3).
    1. 用苏木精溶液染色8分钟。
    2. 用流动的自来水冲洗5分钟，然后用蒸馏水快速冲洗一次。
    3. 用95%乙醇冲洗1分钟，然后在伊红溶液中复染1分钟。
    4. 脱水（80% 乙醇 10-30 秒，100% 乙醇 1 分钟，100% 甲苯 3 分钟）。
    5. 用盖玻片封片，室温下过夜干燥载玻片。
      注意：染色所用溶液可能具有危害性。应使用化学通风橱、规范操作流程及个人防护装备以降低暴露风险。更多信息请参阅材料安全数据表（MSDS）。
  10. 通过Picrosirius Red染色评估右心室纤维化
    注意：在天狼星红染色中，呈酸性的天狼星红与胶原蛋白结合12因此，该染色可用于胶原蛋白含量的组织学检查。
    1. 将切片置于预热至58℃的Bouin溶液中孵育 °C 下 1 小时。
    2. 用流动的自来水冲洗载玻片10-15分钟，以去除切片上的黄色。
    3. 室温下用 0.1% 快绿染色 20 分钟。
    4. 用1%乙酸冲洗1分钟。
    5. 用自来水冲洗5分钟。
    6. 室温下用0.1% Sirius红染色30分钟，随后用甲苯脱水。
      警告：染色所用溶液可能具有危害性。应使用化学通风橱、规范操作流程和个人防护装备以降低暴露风险。更多信息请参阅材料安全数据表（MSDS）。
  11. WGA染色法评估右心室心肌细胞肥大
    注意：右心室（RV）肥厚 在细胞水平上，可通过小麦胚芽凝集素（WGA）染色进行评估（图4).
    1. 将切片置于冷丙酮溶液中固定15分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    2. 用 Dako 溶液在室温下以 10% 山羊血清封闭 30 分钟。
    3. 将切片与WGA孵育：加入1:200稀释的WGA，孵育1小时 ½ 37 ℃下 h °避光保存。
    4. 用 PBS 清洗载玻片三次。
    5. 将载玻片与核酸染料孵育。
    6. 用 PBS 清洗载玻片三次。
    7. 封片时，去除多余液体，加入封片剂并加盖盖玻片。室温避光干燥1小时，随后于4℃保存。 °C.
      注意：染色所用溶液可能具有危害性。应使用化学通风橱、规范操作流程和个人防护装备以降低暴露风险。更多信息请参阅材料安全数据表（MSDS）。
  12. 对肺组织进行免疫组化以进一步特异性评估血管重塑。例如，平滑肌细胞染色可用于评估血管的肌化程度，而血管性血友病因子染色可用于观察内皮改变。这些方法在其他文献中已有描述。5.

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结果

在本方案中，我们详细描述了建立缺氧/SU5416小鼠模型以诱导肺动脉高压（PH）的方法。此外，我们还详尽阐述了在观察期结束时进行肺血管和心脏评估所需的全部步骤。

该模型实验设计的概述见图1A13,14。小鼠暴露于常压低氧环境（10% O2），并连续三周每周一次皮下注射SU5416。本方案中用于诱导肺动脉高压（PH）的刺激因素见图1B和1C。

VEGF 受体拮抗剂 SU5416 通过诱导内皮细胞凋亡发挥作用，从而允许抗凋亡内皮细胞增殖。这会导致肺血管系统的血管重塑和血管阻力增加5。肺循环压力升高会增加右心室（RV）的后负荷，并逐渐导致右心室功能障碍和衰竭

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讨论

本方案描述了通过结合两种病理刺激——慢性缺氧和SU5416注射（缺氧/SU5416）——在小鼠中建立肺动脉高压（PH）模型的方法18。为了将该小鼠模型与人类PH疾病状态相关联，必须参考当前的PH分类，如表1所示。几乎所有类型的PH均以肺血管收缩以及内皮细胞和平滑肌细胞的异常增殖为特征。这会导致肺动脉压力升高，进而增加右心室的后负荷。

在对肺动脉高压（PH）动物模型进行表征时，每一项研究都应包含肺血管和右心室组织病理学重塑的证据。单一打击（缺氧）小鼠模型仅导致轻度的血管重塑2,3。此类病理改变包括原本无肌层的血管出现肌层化，并伴有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖。当增加第二次打击（SU5416注射）后，这些病变会进一步加重。在单一打击（缺氧）模型中，这些改变是可逆的；而在缺氧/SU5416模型中，仅部分可逆。 

肺动...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究获得了美国心脏协会（AHA-17SDG33370112 和 18IPA34170258）以及美国国立卫生研究院 NIH K01 HL135474（资助对象：Y.S.）的资助。O.B. 获得了德国心脏基金会（Deutsche Herzstiftung）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冰醋酸Roth3738.1
丙酮，组织学级The Lab DepotVT110D
ADVantage 压力-容积系统TransonicADV500
Bouin 氏液SigmaHt10132
电凝系统Fine Science Tools18000-00
连接管路和阀门
棉签Covidien8884541300
盖玻片，24×50 mmRoth1871
数据采集与分析系统Emkaiox2
直接红 80Sigma365548-5G
DMSO（二甲基亚砜）Sigma Aldrich276855
干冰
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-10
Dumont #7 精细镊子Fine Science Tools11274-20
包埋模具Sigma AldrichE-6032
水溶性伊红溶液SigmaHT110216
乙醇，实验室级Carolina Biological Supply Company861285
快绿 FCFSigmaF7252-5G
精细剪刀Fine Science Tools14090-09
羊血清invitrogen16210-064
加热垫 Gaymar T/Pump
苏木精 2Thermo Scientific7231
低氧培养箱BiospherixA30274P
诱导麻醉舱DRE Veterinary12570
插管导管（静脉导管 SurFlash (20 G × 1")）Terumo SR*FF2025
眼科剪Fine Science Tools14084-08
异氟烷BaxterNDC-10019-360-40
异氟烷蒸发器DRE Veterinary12432
小鼠 (C57BL/6)Charles River
针头 25 G × 5/8"BD305122
OCT 包埋剂Tissue Tek4583
PBS（磷酸盐缓冲液）Corning21-031-CV
苦味酸饱和溶液 1.3%SigmaP6744-1GA
压力-容积导管TransonicFTH-1212B-4018
牵开器Kent ScientificSURGI-5001
静态氧控制器 ProOx 360BiospherixP360
SU 5416Sigma AldrichS8442
外科缝线，黑色编织丝线，5.0Surgical Specialties Corp. SP116
手术胶带3M1527-1
10 ml 注射器BD303134
带针头的 1 ml 注射器BD309626
Sytox Green 核酸染料Thermo ScientificS7020
肌腱剪Pricon60-521
甲苯Roth9558.3
呼吸机 CWESAR-830/P
WGA Alexa Fluor Thermo ScientificW11261
二甲苯Roth

参考文献

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