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방법 논문

수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

4.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59292

⸱

2019년 5월 2일

 , 
1Laboratory for Neurobiology of Synapse, RIKEN Brain Science Institute, 2Liver Cancer Prevention Research Unit, RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, 3Laboratory for Systems Molecular Ethology, RIKEN Center for Brain Science

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 수지상 필로포디알 사이의 특이적이고 강한 친화력을 활용하여 배양된 해마 뉴런상의 식수컵형 돌출 구조로부터 수지상 필로포디아가 풍부한 분획을 정화하는 방법을 소개합니다. 접착 분자, TLCN, 및 세포외 매트릭스 분자, vitronectin.

초록

수지상 필로포디아는 액틴 필라멘트에 기초하여 얇고 긴 돌출부이며, 표적 축색을 찾는 것처럼 확장하고 후퇴합니다. 수지상 필로포디아가 표적 축색과 접촉하면 척추로 성숙하기 시작하여 시냅스의 형성으로 이어집니다. 텔렌세팔린 (TLCN)은 수지상 필로포디아에 풍부하게 국한되어 있으며 점차 척추에서 제외됩니다. 배양된 해마 뉴런에서 TLCN의 과발현은 수지상 우포ODIa 형성을 유도한다. 우리는 텔렌스팔린이 세포외 매트릭스 분자인 비트로네틴에 강하게 결합한다는 것을 보여주었습니다. Vitronectin 코팅된 마이크로비드는 신경 모수석에 식세포 컵 형성을 유도했습니다. 식세포 컵, TLCN, 인산화 된 에즈린 / 라디신 / 모에신 (포스포 - ERM) 및 F-액틴과 같은 TLCN 결합 단백질이 축적되어 식세포 컵의 성분이 수지상 필로포디아와 유사하다는 것을 시사합니다. 따라서 수지상 필로포디아 대신 식세포 컵을 정화하는 방법을 개발했습니다. 마그네틱 폴리스티렌 구슬은 비트론틴으로 코팅되었고, 이는 해마 뉴런의 배양 배지에 풍부하게 존재하며 뉴런 모수석에 식세포 컵 형성을 유도합니다. 24시간 배양 후, 식세포 컵을 세제로 경미하게 용해시키고 자석 분리기를 사용하여 수집했습니다. 구슬을 세척한 후, 결합 단백질을 용출하고 은 염색 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석시켰다. 결합 분획에서, TLCN 및 액틴은 풍부하게 존재했다. 또한, 분획으로부터 확인된 많은 단백질은 수지상 필로포디아로 국소화되었다; 따라서, 우리는 수지상 filopodia 풍부한 분획으로 결합 분획을 명명했다. 이 기사에서는 수지상 필로포디아 가풍부한 분획에 대한 정제 방법에 관한 세부 사항을 설명합니다.

서론

수지상 필로포디아는 척추의 전구체로 생각됩니다. 수지상 필로포디아의 액틴 필라멘트는 확장 및철회를조절1,2,3. 축축액과 접촉 한 후 선택된 수지상 필로포디아가 척추로 성숙을 시작하고 시냅스가4,5로형성됩니다. 척추의 성분은 후진성 밀도 분획6,7의포괄적 인 분석에서 결정되었으며 수지상 필로포디아의 구성 요소는 크게 알려지지 않았습니다. 텔렌스팔린(TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 키나아제, Akt, mTOR, 폴로유사 키나아제 2, CaMKII, 신데칸-2, 파라레민-1, ARF6 및 EphB가 수지상 필로포디아 형성 5,8,9를 조절하는 것으로 나타났습니다. ,10,도 11,수지상 필로포디아에 존재하는 분자의 포괄적인 분석을 위한 방법이 개발되지 않은 반면.

TLCN(ICAM-5)은 특히 가장 로스트랄 뇌 세그먼트에서 가시 뉴런에 의해발현되며, 텔렌세판론(12). TLCN은 세포외 영역, 막막 영역 및 세포질 꼬리13에9 개의 Ig 유사 도메인을 가지고 있습니다. TLCN은 세포외 영역에서 비트로넥틴(VN) 및 LFA-1 인테그린에 결합하고, 세포막 영역에서 프레세닐린을, 세포질 영역에서 인광-ERM 및 α-액티닌에 결합합니다 5,8,14,15 ,16. TLCN은 수지상 필로포디아 및 α-액티닌의 끝에서 인광-ERM을 통해 세포골격에 결합하고 척추 및 수지상샤프트 8,16.

우리는 TLCN의 과발현이 수지상 필로포디아 형성을 강화하고 가시가 필로포디아(10)로 복귀하도록 유도하는 것을 보여주었다. TLCN 세포질 영역에 결합된 에즈린의 구성활성 형태및 강화된 수지상 필로포디아형성 8. 따라서 TLCN은 액틴 결합 단백질을 통해 수지상 필로포디아 형성을 조절합니다. Esselens 외. 마이크로비드가 배양된 뉴런에 TLCN 축적을 유도한다는 것을 입증했다17. 우리는 식세포 컵 구조가 TLCN 의존적인 방식으로 VN 코팅 된 마이크로 비드 주위의 신경 모수석에 형성되었다는 것을 보여주었다15. 수지상 필로포디아의 성분은 식세포 컵과 유사합니다. 수지상 필로포디아를 수집하는 것은 어렵지만 자기 마이크로 비드를 사용하여 식세포 컵을 수집하는 것이 상대적으로 쉽습니다. 따라서 수지상 필로포디아(18) 대신 식수구컵을 정화하는 방법을개발하였다. 여기서, 수지상 필로포디아 풍부 분획에 대한 정제 방법을 설명한다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 RIKEN Wako의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 해마 뉴런의 문화

  1. 배양 배지의 준비
    1. 200x 비타민 믹스의 준비. D-판토텐산 헤미칼슘 염 100 mg, 콜린 염화물 100 mg, 엽산 100 mg, 이노시톨 180 mg, 나이아신아미드 100 mg, 피리독살 HCl 100 mg, 그리고 500 mL의 초순수 수분 으로 티아민 HCl 100 mg을 용해하십시오. 용액이 완전히 용해되지 는 않습니다. 조심스럽게 혼합, 50 mL 튜브에 aliquot및 -20 °C에서 저장.
    2. 리보플라빈 용액의 준비. 자기 교반기로 500 mL의 초순수에 리보플라빈 100 mg을 녹입니다. 용액이 완전히 용해되지 는 않습니다. 조심스럽게 혼합, 50 mL 튜브에 aliquot및 -20 °C에서 저장.
    3. 1 M CaCl2의 준비 . 자기 교반기로 50 mL의 초순수에 CaCl2·2H2O7.35 g을 용해시.
    4. 최소 필수 배지 (MEM)의 준비. 자기 교반기950mL에서 KCl 400 mg, NaCl 6800 mg, NaHCO3,NaH2 PO 158 mg, 4·2H2O,7000 mg의 D-글루코스, 200 mg의 MgSO4-7H2O를 용해한다.
    5. 자기 교반기상 일정한 교반을 가진 1 mL 파이펫을 사용하여 MEM에 1.8 mL의 적정 1.8 mL을 드롭 바이 드롭 방식으로. MEM의 pH를 1 몰/L HCl로 pH 7.25로 조정합니다.
    6. MEM에 5 mL의 200x 비타민 믹스와 200 μL의 리보플라빈 용액을 첨가하십시오. 초순수로 용액의 부피를 1,000mL로 조정합니다. 0.22 μm 필터 시스템을 사용하여 용액을 걸과 4°C에 보관하십시오.
    7. 10x DNase-I 재고 솔루션 준비. 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)의 12.5 mL에 DNase-I 100 mg을 용해하고 0.22 μm 필터를 통해 필터, 1.5 mL 튜브의 aliquot를 통해 튜브를 -20 °C에 보관하십시오.
    8. 시토신 β-D-아라비노노사이드(Ara-C) 스톡 용액의 제조. 8.93 mL의 초순수(최종 농도 10mM)에 25mg의 아라-C를 용해하고, 0.22 μm 필터를 통해 필터를 적용하고, 1.5mL 튜브에 aliquot를 적용하고 -20°C에서 보관하십시오.
    9. 도금 매체의 준비. MEM 아미노산 용액 1 mL, 750 μL 의 1 M HEPES, B27의 1 mL, 200 mM 글루타민의 125 μL, 페니실린/스트렙토마이신 250 μL, 태아 소 혈청 2.5 mL(FBS), MEM 의 44.375 mL을 혼합합니다.
    10. 중지 매체의 준비. MEM 아미노산 용액 1 mL, 1 M HEPES 750 μL, FBS 5 mL (최종 10%), 그리고 50 mL 튜브에 MEM 43.25 mL을 혼합합니다.
  2. 폴리-L-리신 코팅 요리 준비
    1. 25 °C에서 1 일 동안 폴리 L-리신 하이드로 브로마이드0.2 mg / mL로 35mm 플라스틱 세포 배양 접시를 코팅하십시오.
      참고: 폴리-L-리신 대신 폴리-L-리신 하이드로마이드를 사용해서는 안 됩니다.
    2. 2 mL의 초순수로 3 회 설거지하십시오. 1.5 mL의 스톱 배지를 25°C에서 사용 후 배양합니다.
  3. 마우스 배아에서 해마 뉴런의 해부
    1. 해마 뉴런의 조직 소스. 루 외19의방법에 따라 16-17일 동안 야생형 및 TLCN 결핍 C57BL6/J 마우스로부터 해마를 해부한다.
    2. 배양해 해마를 0.25% 트립신과 1x DNaseI에서 15 mM HEPES를 함유하고, pH 7.2를 37°C에서 37°C에서 교반하여 3분마다 용액을 제거한다. 해마를 10 mL의 STOP 배지에서 배양하여 4°C에서 트립신을 5분 동안 비활성화한다.
    3. 해마를 신선한 STOP 배지 의 10 mL로 이동하고 5 분 동안 4 °C에서 4 °C로 배양하고 4 °C에서 4 °C로 배양하십시오. mL 튜브. 1 mL 파이펫을 사용하여 20 회 파이펫팅하여 해마를 고립 된 뉴런으로 해리하십시오.
      참고: 1 mL 파이펫의 끝은 해마의 해리 동안 15 mL 튜브의 바닥에 약간 닿습니다.
    4. 도금 매체의 9 mL를 추가하고, 50 mL 튜브에 70 μm 세포 스트레이너를 통해 필터링합니다. 혈세포계를 사용하여 셀 수를 계산하고 도금 매체에서 3.5 x 104 셀 /mL로 조정합니다.
    5. 폴리-L-리신 코팅 접시에서 STOP 매체를 흡인합니다. 7 x 104 세포 / 접시 (2 mL / 접시)에서 폴리 L-리신 코팅 접시에 세포를 접시.
    6. 37°C에서 5% CO2 미만의 배양 60-64시간 후, 2 μL의 아라-C 스톡 용액(최종 10 μM)을 뉴런에 넣고 천천히 접시를 흔들어 줍니다. 배양접시를 37°C에서 5% CO2 미만의 배양배지를 변경하지 않고 가습상자에 보관한다.

2. 수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

  1. 13일 간 시험관 내(DIV)를 마친 후, 배양된 뉴런을 함유한 20가지 접시에 마그네틱 폴리스티렌 마이크로비드(3 x 106 입자/접시)를 추가합니다. 1일 후, PBS의 1 mL에서 뉴런을 교반으로 3회 세척하여 배지 및 언바운드 마이크로비드를 제거하였다. PBS를 제거 한 후, 용해 완충액의 500 μL / 접시로 뉴런을 용해시 (0.01 % 트리톤 X-100, EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 및 인산염 억제제 칵테일를 함유한 PBS).
  2. 세포 스크레이퍼로 용해액을 수집하고 용해액을 저단백 결합 마이크로튜브(10튜브)로 이동시다. 자석 분리기에 튜브를 설정하고 1 분 동안 기다립니다. 상류를 수집하고 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석을위한 언 바운드 분수로 사용합니다.
  3. 비드를 새로운 저단백 결합 마이크로튜브로 옮기고, 자기 분리기 상에 설정하고, 상층체를 완전히 제거한다. 용해 완충액 500 μL을 추가하고 15 s. 자석 분리기에 튜브를 설정하고, 1 분 동안 기다렸다가 상구를 제거하고, 용해 완충액 500 μL을 추가하십시오. 구슬의 세척을 10 번 반복하고 상한을 제거합니다.
  4. 1x SDS 샘플 버퍼(62.5mTris HCl, pH 6.8, 2.5% SDS 및 10% 글리세롤)의 50 μL을 첨가하여 비드(경계 분수)에 결합된 용황 단백질을 5분 동안 98°C에서 끓이고, 10s에 대해 860 x gg의 튜브를 원심분리하고 10s튜브를 설정합니다. 1 분 동안 자기 분리기에서 상한체를 수집하고 바운드 분수로 사용합니다.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  5. BCA 단백질 분석방법으로 결합되지 않은 분획의 단백질 농도를 측정합니다. 브로모페놀 블루로 단백질 용액을 시각화하고 SDS-PAGE의 농도를 5 ng/μL로 조정합니다.

3. 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석

  1. 5-20% 그라데이션 겔을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 바운드 및 언바운드 분획(50 ng)을 분리한다. 젤을 은색으로 얼룩.
  2. 항 TLCN-C (1/3,000), 항소 비트론틴 (1/5,000), 항 액틴 (1/1,000), 및 항 α-tubulin (1/1,000)을 1 차 항체및 HRP-접포 염소 항 토끼 IgG (1/5,000)를 사용하여 서쪽 얼룩. 화학 발광 웨스턴 블로팅 검출 시약 및 화학 발광 이미저를 사용하여 항원을 시각화합니다.

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결과

배양된 해마 뉴런에서, TLCN은 수지상 필로포디아, 샤프트 및 소마에 풍부하게 국소화되었고 F-액틴(도1A,B)으로 국소화되었다. 폴리스티렌 마이크로비드가 배양된 해마 뉴런에 첨가되었을 때, 구슬은 배양 배지에서 태아 소 혈청(FBS)으로부터 유래된 비트로넥틴(VN)으로 자동 코팅되었다; 그들은 주로 수상돌기와 결합되었고, 식세포 컵의 형성을 유도하였다 (그림 1B-E). 식세포 컵은 수상돌기위에 마이크로비드 주위의 시트 모양의 액틴 필라멘트를 기반으로 했습니다. 수지상 필로포디아의 마커인 TLCN, 포스포-ERM 및 PI(4,5)P2는 비드 주위에서 고도로 축적된다(도1D)8,<...

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토론

우리는 세포 부착 분자 TLCN과 세포 외 매트릭스 단백질 비트로넥틴 사이의 친화성을 사용하여 수지상 필로포디아가 풍부한 분획에 대한 정제 방법을 개발했습니다. PSD 분획에 비해, 수지상 필로포디아 가 풍부한 분획으로부터 미성숙 시냅스상에 작용하는 시냅스 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 수지상 필로포디아-풍부한 분획의 성분은 74%에 의해 PSD 분획의 성분과 상이하다. PSD 분획과는 달리, 우리는 배양 된 해마 뉴런을 사용하여 식세포 컵을 적극적으로 형성했으며 세포는 살아 있어야합니다. 식세포 컵을 형성하기 위해, 우리는 TLCN과 vitronectin 사이의 상호 작용을 사용했다. TLCN 발현은 텔렌세팔론에서 제한된다. 따라서, 우리는 소뇌에서 파생 된 배양 뉴런을 사용할 수 없습니다. 그러나, 우리가 다른 단백질로 구슬을 코팅하는 경우에, 이 활동 의존적인 정제 방법은 소뇌 신경에 적용될 수 있었습니다. 예를 들어, 글루타메이트 수용체 delta2-코팅된 마이크로비드의 N-말단 도메인이 소뇌 과립 세포에 적용될 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

해마 뉴런의 저밀도 배양, TLCN 결핍 마우스를 위한 미시나 마사요시, 기술 지원을 위한 미쓰이 사치코, 시오자키 모모코, 요시하라 연구소 회원에게 도움이 되는 토론에 대해 감사합니다. . 이 작품은 JSPS 카켄히 그랜트 노스에 의해 지원되었다. JP20700307, JP22700354, JP24500392 및 MEXT 카켄히 그랜트 노스. JP23123525 ~ YF 및 JP20022046, JP18H04683 및 JP18H05146 ~ YY.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 m hepesGibco15630-080
1.7 mLl 낮은 바인딩 MCTSorenson BioScience39640T
200 mM L-글루타민Gibco2530149
35 mm 플라스틱 세포 배양 접시Corning430165
안티 액틴시그마 알드리치A-5060
안티 알파 - 악티닌시그마 알드리치A-5044
안티 알파 튜불린시그마 - 알드리치T-9026
안티 에즈린시그마 - 알드리치클론 3C12, SAB4200806
안티 - 갈판산타 크루즈sc-393
안티 MAP2케미콘클론 AP20, MAB3418
안티 - 모신시그마 - 알드리치클론 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1Santacuzsc-5291
Anti-PSD95MA2ABR
Anti-Spectrin betaChemiconMAB1622
B27Gibco0080085SA
BCA 단백질 분석 키트Thermo23227
Bromophenol blueMerck1.08122.0005
칼슘 chrolide, 함수Wako038-19735
세포 스크레이퍼Falcon353085
세포 여과기Falcon352350
염화 콜린Sigma-AldrichC7527
Complete EDTA free 프로테아제 억제제 칵테일Roche11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranosideSigma-AldrichC-6645
DNase-I, 시그마-알드리치DN-25
D-판토텐산, 헤미칼슘염, 시그마-알드리치P5155
DynaMag-2 자석열12321D
ECL, 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약GERPN2232
e-PAGEL, 5-20% SDS-PAGE, 구배 겔ATTO, E-T520L
엽산Sigma-AldrichF8758
HBSSGibco14175095
HRP 결합 항토끼 IgGJackson ImmunoResearch111-035-144
i-InositolSigma-AldrichI7508
LAS-1000 miniFuji FilmLAS-1000 miniWB 멤브레인에서 발광 감지용
자성 폴리스티렌 마이크로비드SperotechPM-20-10
MEM 아미노산 용액Gibco11130-05130 mM L-아르기닌 염산염, 5 mM L-시스틴, 10 mM L-히스티딘 염산염-H2O, 20 mM L-이소류신, 20 mM L-류신, 19.8 mM L-라이신 염산염, 5.1 mM L-메티오닌, 10 mM L-페닐알라닌, 20 mM L-트레오닌, 2.5 mM L-트립토판, 10 mM L-티로신 및 20 mM L-발린
미니 슬랩 크기 전기영동 시스템ATTOAE-6530
나이아신아마이드시그마-알드리치N0636
페니실린/스트렙토마이신Gibco15070063
PhosSTOP 인산가수분해효소 억제제 칵테일Roche4906845001
Poly-L-lysine 하이드로브로마이드Nacali28360-14
피리독살 HCl시그마-알드리치P6155
리보플라빈,시그마-알드리치R9504
실버 스테인 2 키트, 와코와코291-5031
티아민 HCl, 시그마-알드리치T1270
트랜스 블롯, SD 반건조 전사 셀Bio-rad1703940JA
초순수MilliQ초순수 생산용
, , , , , , , , , , , , , , , , ,

참고문헌

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