Untersuchung normaler Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Dezellularisierung und anschließenden Hydrogelbildung von murinen Brustfettpolstern nach ex vivo Bestrahlung dar.

Abstract

Strahlende Strahlung ist eine Therapie für Patienten mit dreifach negativem Brustkrebs. Die Wirkung der Strahlung auf die extrazelluläre Matrix (ECM) von gesundem Brustgewebe und ihre Rolle bei der lokalen Rezidivanz an der primären Tumorstelle sind unbekannt. Hier stellen wir eine Methode zur Dezellularisierung, Lyophilisierung und Herstellung von ECM-Hydrogelen aus murinen Brustfettpolstern vor. Die Ergebnisse werden über die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses vorgestellt und rheologische Parameter bewertet. GFP- und luziferase-markierte Brustkrebszellen, die in den Hydrogelen verkapselt sind, zeigten eine Zunahme der Proliferation in bestrahlten Hydrogelen. Schließlich wurde Phalloidin-Konjugatfärbung eingesetzt, um die Zytoskelett-Organisation von verkapselten Tumorzellen zu visualisieren. Unser Ziel ist es, eine Methode zur Herstellung von Hydrogelen für In-vitro-Studien zu präsentieren, die die in vivo Brustgewebeumgebung und ihre Reaktion auf Strahlung imitieren, um das Verhalten von Tumorzellen zu untersuchen.

Introduction

Krebs ist gekennzeichnet durch übermäßige Proliferation von Zellen, die Apoptose umgehen und auch metastasieren zu entfernten Stellen¹. Brustkrebs ist eine der häufigsten Formen bei Frauen in den USA, mit schätzungsweise 266.000 neuen Fällen und 40.000 Todesfällen im Jahr 2018². Ein besonders aggressiver und schwer zu behandelnder Subtyp ist dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), dem es an Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR) und menschlichem epidermalen Wachstumsfaktor (HER2) mangelt. Strahlentherapie wird häufig bei Brustkrebs verwendet, um Resttumorzellen nach Derlumpektomie zu beseitigen, aber über 13% der ....

Protocol

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.

1. Vorbereitung und Ex-vivo-Bestrahlung von MFPs

1. Opfern Sie athymische Nu/Nu-Mäuse (8–10 Wochen) mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation.
2. Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol.
3. Sammeln Sie Brustfettpolster (MFPs) von geopferten Mäusen mit vorsterilisierten Scheren und Zangen in einem 15 ml konischen Rohr, das komplette RPMI-Medien enthält (RPMI ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin und 10% feta....

Results

MFPs wurden nach beeimtisiert erwerden, indem das in Abbildung 1Adargestellte Verfahren verwendet wurde. Gezeigt werden MFPs vor der Dezellularisierung (Abbildung 1B) und die Post-Dezellularisierung (Abbildung 1C). Die Dezellularisierung wurde mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung bestätigt, und 1-([4-(Xylyl)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung wurde verwendet, um den Lipidgehalt zu bewerten (Abbildung 2). Die rheologisc.......

Discussion

Diese Methode der Hydrogelbildung ist weitgehend abhängig von der Menge des Ausgangsgewebes. Murine MFPs sind klein, und der Dezellularisierungsprozess führt zu einer signifikanten Verringerung des Materials (Tabelle 1). Der Prozess kann mit mehr MFPs wiederholt werden, um die Endausbeute zu erhöhen. Das Fräsen ist ein weiterer wichtiger Schritt, der zu Materialverlust führen kann. Andere haben Erfolg mit einer kryogenen Mühle gezeigt, aber dieses Protokoll basiert auf Fräsen über einen Handmörtel und el.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutrales gepuffertes Formalin, Würfel mit Zapfen	VWR	16004-128-2-Methylbutan
	Alfa Aesar	19387-AR
2000ex Rheometer	TA Instruments	10D4335	Rheometer
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G-Calcein
Acetoxymethyl (Calcein AM)	Molecular Probes, Inc.	C1430-D-Luciferin
Firefly, Kaliumsalz	Biosynth Chemie & Biologie	L-8820	(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolcarbonsäure Kaliumsalz
DPX Eindeckmittel für die Histologie	Sigma-Aldrich	06522-500ML-Dulbeccos
phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	14040133-Eosin-Y
mit Phloxin	Richard-Allan Scientific	71304
	Molekulare Sonden, Inc.	E1169	Ethidium-Homodimer-1 (EthD-1)
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Kryostat-Einbettungsmedium
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Einbettmedium auf wässriger Basis
FreeZone 4.5	Labconco	7751020	Gefriertrockner
Hoechst 33342 Lösung (20 mM)	Thermo Scientific	62249	blauer Fluoreszenzfarbstoff
Salzsäure	Sigma-Aldrich	258148-500ML-IVIS
Lumina III	PerkinElmer	CLS136334	Biolumineszenz-Bildgebungssystem
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		Zarte Arbeitstücher
n-Propanol (peroxidfrei/Sequenzierung), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500-Öl
Rot O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinder	OPS Diagnostics, LLC	CG-08-02-PBS
(10X), pH 7,4	Qualität Biological, Inc.	119-069-151	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122-Pepsin
aus der Magenschleimhaut des Schweins	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Pepsin
Peressigsäure	Sigma-Aldrich	77240-100ML-Phalloidin-iFluor
594 Reagenz (ab176757)	abcam	ab176757	Phalloidin-Konjugat
Propylenglykol	Sigma-Aldrich	W294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series Bläureagenz	Richard-Allan Scientific	7301L	Bläuungsmittel
Richard-Allan Scientific Signature Series Hämatoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211-RPMI
Medium 1640	Gibco	11875-093-Natriumdesoxycholat
, 98%	Frontier Scientific	JK559522	Desoxycholsäure
Saccharose	Sigma-Aldrich	S5016-Triton
x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	em>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0,25%), phenolrot	Gibco	25200-056-Whatman
qualitatives Filterpapier, Klasse 4	Whatman	1004-110	qualitatives Filterpapier der Klasse 4
Xylole (ACS-zertifiziert), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-4	-