Gli effetti trans e multigenerazionali delle sostanze chimiche persistenti sono essenziali per giudicare le loro conseguenze a lungo termine nell'ambiente e sulla salute umana. Forniamo nuovi metodi dettagliati per studiare gli effetti trans e multigenerazionali utilizzando il nematode free-living Caenorhabditis elegans.
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Articolo metodologico
Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le informazioni sulle tossicità delle sostanze chimiche sono essenziali nella loro applicazione e nella gestione dei rifiuti. Per le sostanze chimiche a basse concentrazioni, gli effetti a lungo termine sono molto importanti nel giudicarne le conseguenze nell'ambiente e sulla salute umana. Nel dimostrare influenze a lungo termine, gli effetti delle sostanze chimiche nel corso delle generazioni negli studi recenti forniscono nuove informazioni. Qui, descriviamo protocolli per studiare gli effetti delle sostanze chimiche su più generazioni utilizzando nematode Caenorhabditis elegansfree-living . Sono presentati due aspetti: (1) studi di effetti transgenerazionali (TG) e (2) di effetti multigenerazionali, quest'ultimo dei quali è separato da studi di esposizione multigenerazionale (MGE) e residuio multigenerazionale (MGR). Lo studio sugli effetti TG è robusto con un semplice scopo per determinare se l'esposizione chimica ai genitori può provocare conseguenze residue sulla prole. Dopo che gli effetti sono misurati sui genitori, le soluzioni di ipoclorito di sodio vengono utilizzate per uccidere i genitori e mantenere la prole in modo da facilitare la misurazione degli effetti sulla prole. Lo studio sugli effetti TG viene utilizzato per determinare se la prole è interessata quando il genitore è esposto agli inquinanti. Lo studio degli effetti MGE e MGR viene utilizzato sistematicamente per determinare se l'esposizione generazionale continua può provocare risposte adattative nella prole nel corso delle generazioni. Un attento pick-up e trasferimento sono utilizzati per distinguere le generazioni per facilitare la misurazione degli effetti su ogni generazione. Abbiamo anche combinato protocolli per misurare il comportamento di locomozione, la riproduzione, la durata della vita, i cambiamenti biochimici e dell'espressione genica. Alcuni esperimenti di esempio sono presentati anche per illustrare gli studi sugli effetti trans e multigenerazionali.
Introduzione
L'applicazione e la gestione dei rifiuti di sostanze chimiche dipende fortemente dalle informazioni dei loro effetti a determinate concentrazioni. In particolare, il tempo è un altro elemento essenziale tra effetti e concentrazioni. Vale a dire, le sostanze chimiche, soprattutto quelle a basse concentrazioni negli ambienti reali, hanno bisogno di tempo per provocare effetti misurabili1. Pertanto, i ricercatori organizzano diverse lunghezze della durata dell'esposizione negli esperimenti sugli animali e coprono anche l'intero ciclo di vita. Ad esempio, i topi sono stati esposti alla nicotina per 30, 90 o 180 giorni per studiare i suoi effetti to....
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Protocollo
1. Cultura E. coli OP50
- Preparare la soluzione di idrossido di sodio da 1 M sciogliendo 4 g di idrossido di sodio in acqua di 100 mL.
- Preparare il brodo di lisogenità (LB) medio sciogliendo 10 g di tripone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio con 1 L di acqua ultrapura in una fiaschetta conica 1 L. Regolare il pH a 7,0 con una soluzione di idrossido di sodio da 1 M.
- Aliquota del supporto liquido LB da passo 1.2 a 20 flaconi conici (volume massimo consentito: 100 mL) con 50 mL di mezzo in ciascuno. Coprire i flaconi conici con carta kraft.
- Sterilizzare il supporto liquido LB a 121 e 0,105 MPa per 20 m. ....
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Risultati
Qui, descriviamo i protocolli per studiare gli effetti delle sostanze chimiche nel corso delle generazioni utilizzando C. elegans negli studi di esposizione trans-generazionale (TG), esposizione multigenerazionale (MGE) e residui multigenerazionale (MGR). I nostri risultati di ricerca sono presentati come esempi. Uno studio presenta gli effetti TG dei metalli pesanti sul comportamento di locomozione3. Gli altri due studi presentano gli effetti MGE e MGR di.......
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Discussione
Al fine di condurre con successo il protocollo descritto, dovrebbero essere presi in considerazione i seguenti suggerimenti. Eseguire le operazioni sperimentali complessive in un ambiente sterile. Un'operazione impropria può provocare la contaminazione dei ceppi di E. coli, ad esempio, funghi e acari può ostacolare la normale crescita di C. elegans e quindi influenzare i risultati sperimentali. Nella sezione che descrive la coltivazione C. elegans, osservare la scala di crescita di C. elega.......
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Dichiarazioni
Gli autori sono grati per i supporti finanziari del National Science and Technology Major Project for Water Pollution Control and Treatment (2017-X07201004) e del Programma internazionale di cooperazione scientifica e tecnologica della Cina (n. 2016YFE0123700).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| agar in polvere | OXOID, Thermo Fisher Scientific, Regno Unito | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Sistema PCR rapido in tempo reale | Biosistemi applicati | ||
| Micropiastra sterile a 96 pozzetti | Costar? Corning? America | ||
| Sterilizzatore per autoclave | Tomy, Tomy Digital Biology, Giappone | ||
| Armadio di biosicurezza | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, Cina | ||
| cloruro di calcio | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germania | ||
| Provette da centrifuga | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| colesterolo | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 57-88-5 | |
| Dimetil solfossido VETEC | , Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodio idrogeno fosfato | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 7558-79-4 | |
| etanolo | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 64-17-5 | |
| filtro | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubatore | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, Cina | ||
| anello | |||
| di inoculazioneK2HPO4• 3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 16788-57-1 | |
| carta | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4• 7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 10034-99-8 | |
| Microscopi XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM strumenti ottici manufacturing co. Ltd, Cina | ||
| di Petri | |||
| Pipetta | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germania | ||
| Cloruro di potassio | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 7447-40-7 | |
| potassio diidrogeno fosfato | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, Stati | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, Stati | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, Stati Uniti Cloruro | ||
| di sodio | Sinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 7647-14-5 | |
| idrossido di | sodioSinopharm chemical reagent company Ltd, Cina | 1310-73-2 | |
| soluzione di ipoclorito di sodio | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, Cina | 7681-52-9 | |
| triptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| estratto di lievito | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
Riferimenti
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al.
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Ristampe e permessi
