هنا، يصف لنا توليد وتطبيق مجموعة من المعدلة وراثيا التمويل نبات خطوط التعبير إيندوسيبلي، الخاصة بالانسجة مواتية في الخلايا الإنشائية الرئيسية الثلاثة وأرض قمية تبادل لإطلاق النار وأرض قمية الجذر وكامبيوم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التعبير إيندوسيبلي والأنسجة على حدة أداة هامة وقوية لدراسة ديناميات اضطراب الوراثية الزمانية. الجمع بين جرينجاتي بالمرونة والكفاءة الاستنساخ مع نظام ثبت ومرجعية لهجر نظام (يطلق عليها هنا غرام-LhG4) للتعبير إيندوسيبلي، نحن قد ولدت مجموعة من خطوط نبات المعدلة وراثيا التي يمكن أن تدفع بالتعبير عن المستجيب كاسيت بمجموعة من أنواع الخلايا المحددة في الخلايا الإنشائية النباتية الرئيسية الثلاثة. وتحقيقا لهذه الغاية، اخترنا نظام الموارد الوراثية-LhG4 المتقدمة سابقا على أساس عامل نسخ تشيميريك ومروج المشابهة من نوع البوب ضمان رقابة مشددة على مجموعة واسعة من مستويات التعبير. وباﻹضافة إلى ذلك، تصور المجال التعبير التي تنشط فيها عامل النسخ الاصطناعية، يتم ترميز مراسل فلورسنت المترجمة ER mTurquoise2 تحت سيطرة المروج pOp4 أو pOp6 في خطوط برنامج التشغيل. هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء سطر برنامج التشغيل أو المستجيب، وتبين كيف يمكن الناجمين عن خلية محددة نوع التعبير وأتباعه في أرض قمية تبادل لإطلاق النار، وأرض قمية الجذر وكامبيوم من نبات. باستخدام برنامج تشغيل عدة أو كافة خطوط، أثر سياق محدد للتعبير عن أحد أو عوامل متعددة (المستجيبة) تحت سيطرة المروج الاصطناعية البوب يمكن تقييم سرعة، على سبيل المثال في مصانع F1 من عبور بين المستجيب واحدة ومتعددة خطوط برنامج التشغيل. ويتجلى هذا النهج التعبير حمل خارج الرحم من VND7، عامل نسخ NAC قادرة على حمل خارج الرحم الثانوية خلية الجدار ترسب بطريقة ذاتية في خلية.
المقدمة
قيداً رئيسيا في علم الأحياء في عصر بوستجينوميك فك سياق الدور المحدد لعامل معين أو اضطراب الوراثية. كثيرا ما لا تسمح التأسيسي الاضطرابات الوراثية مثل النهج فقدان للوظيفة والكسب من وظيفة تحليل نقطة النهاية لعمليات التكيف مدى الحياة، تشويش التمييز بين الآثار الأولية والثانوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملثمين سياق مهام محددة أو يخفف من آثار واسعة النطاق في أنسجة بعيدة أو خلال مراحل أخرى من التنمية. وعلاوة على ذلك، في الحالات القصوى، يمكن أن يحول دون الفتك أي فكرة آليا. ومن الناحية المثالية، للالتفاف حول هذه القضايا، أحد يمكن تحليل أثر اضطراب الوراثية الحادة داخل سياق محدد مثل نوع خلية محددة بطريقة حل الوقت. ولتحقيق ذلك، هي الأدوات الجينية للخلية إيندوسيبلي، الخاصة بنوع الت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يمكن الحصول على ناقلات ووحدات من المستودع غير هادفة للربح، أدجيني (https://www.addgene.org).
1-الاستنساخ باستخدام جرينجاتي
- تصميم كبسولة تفجير باستخدام يتدلى المدرجة في الجدول 1، استبدال 'NNNN' مع وحدة محول نوع خاص تسلسل المدرجة أدناه: إلى الأمام: 5´AACA جتكتك أ NNNN (ن) CA* + 3´ تسلسل معين، عكس: NNNN A جتكتك 5´AACA (n) + عكس تكملة 3´ تسلسل معين. إضافة قواعد المسطرة لضمان الحفاظ على الإطار القراءة.
يتدلى الوحدة النمطية:
ملاحظة: في إطار جرينجاتي الافتراضية، ست وحدات، واو، يتم تجميعها مع محطة تحول ناقلات العمود الفقري في تعبير واحد بلازميد (الشكل 1). عادة، سوف الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
جيل خطوط السائق والمستجيب عن طريق الاستنساخ جرنجيت
جرينجاتي استنساخ نظام يستند إلى GoldenGate الاستنساخ واستخدام endonuclease تقييد IIS نوع جيش صرب البوسنةأنا أو ما إيسوشيزومير إيكو31I. كما يمكن أن يكون يتدلى تنتج إنزيم بعيدة من موقعها على الاعتراف غير المتناظر، تكوين قاعدة من يتدلى بحرية تشكيل المختار، الذي هو الأساس نمطية للنظام. ويتم إدراج كل عنصر ولدت بكر، على سبيل المثال، تسلسل منظم أو الأقراص المدمجة أو المنهي، أولاً ناقل إدخال معينة مع مطابقة يتدلى الم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء وتطبيق مجموعة أدوات متنوعة وشاملة لنوع الخلية إيندوسيبلي، محددة ترانس-التنشيط. عبور خطوط تحمل أشرطة الكاسيت المستجيب تحت سيطرة المروج البوب مع خطوط برنامج تشغيل يسمح لدراسة آثار سوء التعبير في الجيل F1، تمكين التقييم السريع لاضطراب الوراثية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. وبدلاً من ذلك، المستجيب بنيات يمكن استخدامها لتحويل خطوط برنامج التشغيل، أو بتكييف استراتيجية الاستنساخ وسائق والمستجيب بناء يمكن أيضا أن يقترن في تي-دنا واحد. تطبيقات لهذا النظام وتتراوح مكانياً .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
عمل في مختبراتنا معتمد من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) منح WO 1660/6-1 (إلى جنوب غرب) و "الموارد الوراثية" 2104/4-1 (إلى آثاريا) و SFB1101 (إلى آثاريا و J.U.L) ومجلس البحوث الأوروبي منح consolidator (بلانتستيمس 647148) إلى آثاريا جنوب غرب معتمد من خلال "الزمالة إيمي نويثر" من DFG من خلال منحة WO 1660/2.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| تنقية العمود | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| غرفة الثقافة للتصوير | Sarstedt AG & Co. غرفة | زراعة الأنسجة KG 1 بئر ، على غطاء زجاجي II | |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش | D4903 | |
| DMSO | فيشر العلمي ، المملكة المتحدة | D139-1 | |
| Eco< / em>31I | قنية حقن Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| (0.30 × 12 مم ، 30 جم × 1/2) | Sterican ، Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO لامدا الأزرق 63x الغمر المائي objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA هدف الغمر في الماء | نيكون ، ميناتو ، طوكيو ، اليابان | ||
| طبق بتري 35/10 ملم | Greiner Bio-One GmbH ، ألمانيا | 627102 | |
| طبق بتري 60/150 ملم | Greiner Bio-One GmbH ، ألمانيا | 628102 | |
| طبق بتري 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH ، ألمانيا | 688102 | |
| أجار مصنع | دوشيفا ، هارلم ، هولندا | P1001 | |
| استخراج البلازميد | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep | |
| Kit بروبيديوم يوديد (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | كلاسيك ، Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| أنابيب التفاعل | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG ، باد بيرلبورغ ، ألمانيا | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| مقياس الطيف | الضوئي الحراري فيشر Scientific | NanoDrop 2000c | |
| السكروز | كارل روث GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µ ؛ ل | ثيرمو فيشر العلمي | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µ ؛ ل | ثيرمو فيشر العلمي | EL0013 |
المراجع
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
