可诱导的、细胞类型特异性表达 拟南芥 通过LhGR介导的 转录-激活

摘要

本文描述了一套转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）品系的构建与应用，该品系可在三种主要分生组织——茎尖分生组织、根尖分生组织和形成层中实现可诱导的、组织特异性的基因表达。

摘要

可诱导的、组织特异性表达是研究基因扰动时空动态的重要且强大的工具。通过将灵活高效的GreenGate克隆系统与已验证且作为基准的LhGR系统（本文称为GR-LhG4）相结合，用于实现可诱导表达，我们构建了一组转基因拟南芥品系，可在三种主要植物分生组织的多种特定细胞类型中驱动效应元件表达。为此，我们选用了先前开发的基于嵌合转录因子及其对应顺式作用元件的GR-LhG4系统 pOp型 启动子，可在广泛的表达水平上实现严密调控。此外，为了可视化合成转录因子活性的表达区域，使用由该启动子控制的、定位于内质网的mTurquoise2荧光报告基因 pOp4 或 pOp6 启动子编码在驱动系中。本文描述了构建驱动系或效应系所需的步骤，并展示了如何在茎尖分生组织、根尖分生组织以及维管形成层中诱导并追踪细胞类型特异性表达 拟南芥通过使用一种或多种驱动品系，可在特定背景下研究在人工调控下表达一个或多个因子（效应分子）的作用效果 pOp 启动子可以快速评估，例如在一种效应子与多个驱动系杂交所得的F1代植株中。该策略的一个实例是VND7的异位表达，VND7是一种NAC转录因子，能够以细胞自主的方式诱导异位的次生细胞壁沉积。

引言

在后基因组时代，生物学研究的一个主要局限在于解析特定环境下某一因子或遗传扰动的具体作用。组成型遗传扰动方法（如功能缺失和功能获得策略）通常仅能对终生适应过程进行终点分析，从而模糊了初级效应与次级效应之间的区别。此外，特定环境下的功能可能被远端组织的大范围效应或发育其他阶段的影响所掩盖或稀释。更极端情况下，致死性会阻碍任何机制性研究的开展。理想情况下，为克服上述问题，可在特定细胞类型等具体环境中，以时间分辨的方式分析急性遗传扰动所产生的效应。为此，需要具备可诱导、细胞类型特异性表达功能的遗传工具。¹为了提供一种快速评估特定效应物反应时空动态的资源，我们结合了GreenGate系统在克隆操作上的简便性² GR-LhG4 系统已证实的有效性^3,4,5,6我们构建了一系列表达嵌合型转录因子LhG4与大鼠皮质类固醇受体（GR）配体结合域融合蛋白的品系⁷ 在特征明确的细胞类型特异性启动子的调控下⁸在静息状态下，转录因子位于细胞核外，因为糖皮质激素受体（GR）结构域与胞质中的HSP90结合。加入合成配体....

方案

载体和模块可从非营利性资源库 Addgene（https://www.addgene.org）获取。

1. 使用 GreenGate 进行克隆

1. 使用 表1 中列出的突出序列设计引物，将“NNNN”替换为以下列出的模块类型特异性接头序列：正向引物：5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA^* + 特异性序列 3´，反向引物：5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + 特异性序列的反向互补序列 3´。添加下划线的碱基以确保阅读框的维持。
   模块突出序列：
   ​注意：在默认的 GreenGate 框架中，六个模块 A-F 与植物转化载体骨架组装成一个表达质粒（图1C）。通常，A 模块包含启动子序列，B 模块包含N端标签或“虚拟”序列⁶，C 模块包含编码序列（CDS），D 模块包含C端标签或虚拟序列，E 模块包含终止子，F 模块包含用于筛选转基因植物的抗性盒。可使用用于与其他预组装单元连接的接头替代 F 模块²。
2. PCR 扩增
   1. 根据标准操作流程，使用设计的引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标序列。
   2. 在琼脂糖凝胶上....

结果

通过 GreenGate 克隆技术构建驱动和效应子品系

GreenGate 克隆系统基于 GoldenGate 克隆技术，使用 I 型切口限制性内切酶 BsaI 或其同裂酶 Eco31I。由于该酶在其不对称识别位点之外产生黏性末端，因此黏性末端的碱基组成可自由选择，这构成了该系统模块化设计的基础。每一个通过 PCR 获得的元件（例如启动子序列、CDS 或终止子）首先被插入到具有匹配黏性末端的特定入门载体中，这些黏性末端由限制性酶切产生，从而形成一个模块。在完成亚克隆后，通常将六个匹配的模块用于 GreenGate 连接反应，最终在植物双元载体中组装成完整的构建体。

对于驱动系，将包含组织特异性启动子（pTS）的DNA序列、GR-LHG4转录因子、pOp6启动子以及与N端信号肽和C端内质网滞留信号融合的mTurquoise2报告基因的模块进行连接，同时包括终止子、多种适配模块以及用于转基因筛选的模块，具体构建方法如前所述

讨论

本文描述了构建和应用一种多功能且全面的诱导型、细胞类型特异性trans-激活工具包所需的关键步骤。将携带由pOp启动子调控的效应元件表达盒的品系与驱动品系杂交，可在F1代中研究基因异位表达的效应，从而快速评估多种细胞类型中遗传扰动的结果。此外，也可将效应元件构建体转化至驱动品系中；或者通过调整克隆策略，将驱动元件和效应元件构建体共同构建于同一T-DNA上。该系统应用广泛，包括时空可控的基因异位表达研究、结构域特异性基因敲低或基因编辑，以及细胞类型特异性的功能互补实验。

本文所述的所有实验步骤对于具备常规分子生物学技术条件的实验室而言均不应构成困难。LhG4表达系统经过充分验证，可确保无泄漏且可调节的表达，并能够实现高水平的表达⁸，但我们提醒，诱导剂浓度的动态范围应针对每种驱动系与效应系组合通过实验确定。将这一经过验证的系统与模块化的GreenGate克隆技术相结合，为在任何具有特异性启动子的细胞类型中实现可诱导表达提供了一种快速而简便的方法。我们注意到，在含有pOp-type启动子.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.1
三磷酸腺苷（ATP）	Sigma-Aldrich	A9187
氯霉素	Sigma-Aldrich	C1919
柱层析纯化	Qiagen	QIAquick PCR 纯化试剂盒 (250)
成像用培养室	Sarstedt AG & Co. KG	1 孔组织培养室，置于盖玻片 II 上
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4903
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific, UK	D139-1
Eco31I	Thermo Fisher Scientific	FD0294
注射套管（0.30 × 12 mm，30 G × 1/2）	Sterican, Braun
卡那霉素	Carl Roth GmbH + Co. KG	T832.2
Leica TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜，HCX PL APO lambda blue 63× 水浸物镜	Leica, Wetzlar, Germany
MS 培养基	Duchefa, Haarlem, Netherlands	M0221.0050
Nikon A1 共聚焦激光扫描显微镜，Apo LWD 25× 1.1 NA 水浸物镜	Nikon, Minato, Tokyo, Japan
培养皿 35/10 mm	Greiner Bio-One GmbH, Germany	627102
培养皿 60/150 mm	Greiner Bio-One GmbH, Germany	628102
培养皿 120/120/17	Greiner Bio-One GmbH, Germany	688102
植物琼脂	Duchefa, Haarlem, Netherlands	P1001
质粒提取	Qiagen	QIAprep Spin Miniprep 试剂盒
碘化丙啶（PI）	Sigma-Aldrich	P4170
剃刀刀片	Classic, Wilkinson Sword GmbH	7005115E
反应管	Sarstedt AG & Co. KG	72.690.001
Silwet L-77	Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
壮观霉素	AppliChem GmbH	3834.001
分光光度计	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000c
蔗糖	Carl Roth GmbH + Co. KG	4621.1
磺胺嘧啶	Sigma-Aldrich	S6387
四环素	AppliChem GmbH	2228.0025
T4 连接酶 5 U/µl	Thermo Fisher Scientific	EL0011
T4 连接酶 30 U/µl	Thermo Fisher Scientific	EL0013