Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

5.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59404

⸱

9 июля 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод записи эмбриональных мышечных сокращений в эмбрионах Дрозофилы в неинвазивной и подробно-ориентированной манере.

Аннотация

Скоординированные сокращения мышц являются одной из форм ритмического поведения видели рано во время развития в дрозофилы эмбрионов. Нейронные сенсорные цепи обратной связи необходимы для контроля такого поведения. Неспособность произвести ритмическую картину сокращений может свидетельствовать о неврологических аномалиях. Ранее мы обнаружили, что дефекты в белке O-mannosylation, постпереводной модификации белка, влияют на аксон морфологии сенсорных нейронов и привести к ненормальным скоординированных сокращений мышц в эмбрионах. Здесь мы представляем относительно простой метод для записи и анализа структуры перистальтических сокращений мышц путем живой визуализации эмбрионов поздней стадии до точки вылупления, который мы использовали для характеристики фенотипа белка сокращения мышц O-mannosyltransferase мутантов. Данные, полученные из этих записей, могут быть использованы для анализа волн сокращения мышц, включая частоту, направление распространения и относительную амплитуду мышечных сокращений на разных сегментах тела. Мы также изучили осанку тела и воспользовались флуоресцентным маркером, выраженным специально в мышцах, чтобы точно определить положение среднего эмбриона. Аналогичный подход также может быть использован для изучения различных других моделей поведения во время разработки, таких как катание эмбрионов и вылупление.

Введение

Перистальтический сокращения мышц является ритмическое моторное поведение, аналогичное ходьбе и плаванию у людей1,2,3. Эмбриональные сокращения мышц видели в Дрозофилы поздней стадии эмбрионов представляют собой пример такого поведения. Дрозофила является отличной моделью организма для изучения различных процессов развития, потому что эмбриональное развитие в дрозофиле хорошо характеризуется, относительно короткий, и легко контролировать. Общая цель нашего метода заключается в тщательной записи и анализе волнообразных моделей сокращения и расслабления эмбриональных мышц. Мы использовали простой, неинвазивный подход, который предлагает детальную визуализацию, запись и анализ мышечных сокращений. Этот метод также может быть потенциально использован для изучения других процессов in vivo, таких как эмбриональный прокат, наблюдаемый в эмбрионах на поздних стадиях эмбрионов непосредственно перед вылуплянием. В предыдущих исследованиях, эмбриональные сокращения мышц в основном были проанализированы с точки зрения частоты и направления1,2. Для того, чтобы оценить относительную степень сокращений, как они прогрессируют вдоль оси тела в передней или задней направлении, мы использовали эмбрионы, выражающие GFP специально в мышцах. Этот анализ предоставляет более количественный способ анализа мышечных сокращений и выявить, как осанка тела в эмбрионах поддерживается во время серии перистальтических волн мышечных сокращений.

Перистальтические сокращения мышц контролируются центральным генератором шаблона (CPG) схемами и связи между нейронами периферической нервной системы (PNS), центральной нервной системы (ЦНС), и мышц 4,5. Неспособность производить нормальные перистальтические сокращения мышц может привести к дефектам, таким как неспособность люк2 и ненормальные личиночного движения6 и может свидетельствовать о неврологических аномалий. Live изображения перистальтических волн сокращения мышц и подробный анализ фенотипов сокращения может помочь выявить патогенные механизмы, связанные с генетическими дефектами, влияющими на мышцы и нейронные цепи, участвующие в передвижении. Недавно мы использовали этот подход для исследования механизмов, которые приводят к осаде тела торсионфеи фенотипа protein O-mannosyltransferase (POMT) мутантов7.

Белок O-mannosylation (POM) является особым типом постпереводной модификации, где манноза сахар добавляется в сыворотки или трионин остатки секреторных белков пути8,9. Генетические дефекты в POM вызывают врожденные мышечные дистрофии (CMD) у людей10,11,12. Мы исследовали возбудительные механизмы этих заболеваний с использованием дрозофилы в качестве модели системы. Мы обнаружили, что эмбрионы с мутациями в протеине Drosophila O-mannosyltransferase генов POMT1 и POMT2 (также известной о вращающемся животе (rt) и витой (tw)) показывают смещение ("вращение") сегментов тела, что приводит к аномальной осанке тела7. Интересно, что этот дефект совпал с стадией развития, когда перистальтические сокращения мышц становятся заметными7.

Поскольку аномальная осанка тела в poM мутантэмбрионов возникает, когда мускулатура и эпидермис уже сформированы и перистальтические волны скоординированных мышечных сокращений начали, мы предположили, что ненормальная осанка тела может быть результатом аномальной мышцы сокращения, а не дефект в мышцах или / и эпидермис морфологии7. CMDs может быть связано с аномальными сокращениями мышц и дефектами осанки13, и, таким образом, анализ осанки фенотипа у мутантов Drosophila POMT может выяснить патологические механизмы, связанные с мышечной дистрофией . Для того, чтобы исследовать связь между осанкой тела фенотипом мутантов Drosophila POMT и возможными отклонениями в перистальтических волнах мышечных сокращений, мы решили детально проанализировать мышечные сокращения с помощью живого подход к визуализации.

Наш анализ перистальтических волн сокращения эмбрионов Дрозофилы выявил два различных режима сокращения, обозначенных как волны типа 1 и типа 2. Тип 1 волны простые волны, распространяющиеся от передней до задней или наоборот. Тип 2 волны двухфазных волн, которые инициируют на передней части, размножаются на полпути в задней направлении, на мгновение остановить, образуя временное статическое сокращение, а затем, во время второй фазы, прокатилась перистальтического сокращения, которое распространяется вперед от заднего конца. Эмбрионы дикого типа обычно генерируют серию сокращений, которая состоит примерно из 75% волн типа 1 и 25%. В отличие от этого, эмбрионы мутантов POMT генерируют волны типа 1 и типа 2 на примерно равных относительных частотах.

Наш подход может предоставить подробную информацию для количественного анализа мышечных сокращений и эмбриона прокатки7. Этот подход может быть также адаптирован для анализа других моделей поведения, связанных с мышечными сокращениями, таких как вылупление и ползание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Подготовка летать клетке, сделав около 50 отверстий в 100 мл потенциала трехугловой пластиковый стакан с помощью горячей 25 G иглы (см. Таблица материалов).
  2. Приготовьте 60 мм х 15 мм петри блюда с яблочным соком-агаром (3% агара и 30% яблочного сока).
  3. Подготовка свежих дрожжей пасты путем смешивания сухих дрожжей гранулы и вода. Распространение дрожжевой пасты на яблочные пластины агара, чтобы увеличить яйцекладка.
  4. Анестезируйте около 50-60 мух (используют примерно одинаковое количество самцов и самок) на CO2 и помещают их в клетку для мух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование повышенной доли самок (до 2:1 соотношение самок: мужчины) может помочь увеличить количество отложенных яиц для некоторых генотипов.
  5. Прикрепите яблочный сок-агар Петри блюдо с дрожжевой пасты к лету клетке плотно и запечатать его с моделированием глины. Убедитесь, что он запечатан на всех углах.
  6. Подождите, пока мухи проснутся от анестезии, а затем инвертировать клетку так, что чашка Петри в настоящее время на дне. Поместите клетку в инкубатор с контролируемой температурой (25 градусов по Цельсию) и влажностью (60%).
  7. Разрешить мухам откладывать яйца на 2-3 ч, заменить яблочную тарелку на свежую, и пусть тарелка с яйцами возраста 19-20 ч в инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед вышеуказанным шагом мухи должны быть синхронизированы, чтобы облегчить сбор эмбрионов 17e-f (19-21 h AEL). Этого можно достичь путем переноса мух в клетку со свежей дрожжевой соком-агарной пластиной 3-4 раза по 12 ч (раз в 3-4 ч). Ведение мух в контролируемой циркадной световой среде (LD цикла) также может помочь в сборе синхронизированной популяции эмбрионов, но это не было существенным в наших экспериментах.

2. Коллекция эмбрионов

  1. Тщательно выбирайте эмбрионы влажной кистью и помещайте их в коллекционную стеклянную тарелку, наполненную 1x PBS.
  2. Выберите эмбрионы, которые имеют свои трахеи заполнены воздухом. Заполненные воздухом трахеи указывают на то, что эмбрионы достигли стадии 17, и их перистальтические сокращения мышц должны были начаться. Трахеи становятся хорошо видны, когда они заполнены воздухом, который может служить маркером для стадии 17.
  3. Поместите яблочный сок агар плиты на стеклянную горку и тщательно перенести эмбрионы из PBS в плиту. Выстраивайте эмбрионы с их брюшной стороной вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дорсальные и брюшные стороны эмбрионов можно отличить по положению придатков на яичной скорлупе.
  4. Сделайте прямоугольную границу воска на другом стеклянном слайде с помощью восковой ручки (см. ТаблицуМатериалов).
  5. Поместите двустороннюю липкую ленту в пределах этой границы и осторожно подберите эмбрионы, опустив этот слайд на агарную плиту. Применить мягкое давление, чтобы убедиться, что эмбрионы придерживаться ленты хорошо, с их доза вверх. При необходимости эмбрионы можно свернуть на ленту, чтобы скорректировать свою ориентацию. Делайте все манипуляции при наблюдении за эмбрионами под микроскопом вскрытия.
  6. Обложка эмбрионов с 1x PBS для живой визуализации мышечных сокращений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые процедуры, описанные выше, связаны с основными методами дрозофилы, используемыми во многих исследованиях. Более подробное описание общих методов Drosophila можно найти в другом месте14.

3. Запись эмбрионов

  1. Выполните живую визуализацию смонтированных эмбрионов на микроскопе эпифлюесценции с функцией замедленного действия и цифровой камерой с подходящими фильтрами для выбросов (см. Таблица Материалов) с помощью объектива объективного объектива 10-кратного погружения воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали эмбрионы, выражающие GFP в мышцах. Другие флуоресцентные маркеры с подходящими наборами ламп возбуждения и наборов фильтров выбросов также могут быть использованы (например, для обнаружения tdTomato, можно использовать фильтр Chroma ET-561 для возбуждения и выбросов около оптимальных 554 нм и 581 нм, соответственно).
  2. Выполните живую видеозапись эмбрионов с помощью подходящего программного обеспечения (см. Таблица Материалов) около 1-2 ч с частотой приобретения 4 кадров/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа прокатки развивающегося эмбриона в его оболочке можно использовать эмбрионы без выражения флуоресцентных маркеров. С этой целью для визуализации движения эмбриона в оболочке применяется регулярное передаваемое световое освещение без спектральных фильтров (см. Фильм2).

4. Анализ записей

  1. Экспорт записанное видео непосредственно в Image J для дальнейшего анализа (например, в виде файлов AVI).
  2. В ImageJ, обрезать видеозаписи до размера отдельных эмбрионов, рисуя коробку вокруг каждого эмбриона, а затем нажав на изображение Это значительно уменьшает размер видеофайлов, не влияя на их разрешение и облегчает их анализ.
  3. Поверните обрезанные изображения для достижения вертикального положения эмбриона средней линии по отношению к экрану, нажав на изображение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор Preview в ходе этого процесса обеспечит руководство для вращения, показывая сетки для обеспечения вертикального положения средней линии.
  4. Количественный анализ подвижного состава эмбрионов :
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Для анализа расстояния сначала подтвердите, что ваши изображения содержат информацию о масштабах. Масштаб изображения может быть добавлен, выбрав Анализ (Rugt; SetScale), а затем введя преобразование пикселей на расстояния, например, микрометры
    1. Отметьте положение одной или обеих трахеей в первом кадре видео в точке на полпути между задними и передними концами. Нажмите на Анализ ,gt; Инструменты и рентабельность инвестиций менеджер и записать эту позицию, как срез числа-у координат-х координат, нарисовав коробку примерно 7 мкм на 7 мкм вокруг него и набрав т на клавиатуре. Убедитесь, что при вводе tна видео выбирается интересующий регион. Кроме того, выберите вкладку Добавить (т) на менеджере ROI для записи положения трахеи вместо ввода команды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Область интереса может варьироваться в форме или размере в зависимости от эмбриональной области или развития события изучается.
    2. Отметьте положение одной и той же области трахеи после каждого перистальтального сокращения. Измерьте расстояние от положения предварительного сокращения до положения после сокращения, нарисовав линию, соединяющую центры каждой коробки и набрав м на клавиатуре. Преобразуйте расстояние до мкм, используя известный масштаб изображений. Кроме того, измерьте расстояние в мкм в один шаг, нажав на анализную шкалу и введите известный пиксель-микрон коэффициент преобразования, чтобы дать отчет в микронах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние в пикселях можно ввести вместе с соответствующим расстоянием в мкм.
    3. Соотнесите расстояние и направление каждого подвижного события с направлением распространения мышечного сокращения по крайней мере 8 эмбрионов для статистически значимых различий.
  5. Количественный анализ эмбриональных мышечных сокращений:
    1. Используйте эмбрионы, выражающие флуоресцентные маркеры в мышцах (например, мы использовали трансгенные мухи, выражающие конструкцию синтеза Myosin Heavy Chain promoter и GFP под названием MHC-GFP5) для анализа параметров сокращения мышц, таких как амплитуда сжатия.
    2. Используйте запись флуоресцентного считывания и нарисуйте интересуемый регион (например, коробка от 15 мкм до 45 мкм (HXW) по центру на мышцах (которые хорошо видны из-за присутствия флуоресцентного маркера) определенного сегмента тела, и выберите вкладку Add (t) на th e roI менеджер для записи позиции рентабельности инвестиций. Нажмите на менеджер roI (RUI) и измерьте среднюю интенсивность флуоресцентных материалов каждого региона, который подбирается для каждого кадра видео.
    3. Переместите коробку в центры других сегментов тела, представляющих интерес, и нажмите на Add (t) в менеджере roI, чтобы записать свои позиции. Это даст регионам, представляющим интерес идентичный размер во всех сегментах тела, которые будут проанализированы. Выберите по крайней мере один задний, один медиаленный и один передний сегмент, например, A7, A4 и T2, соответственно.
    4. В roI менеджер, выберите все регионы, представляющие интерес, записанные как срез числа-у координат-x координат (например, выбрав при проведении Ctrl) и нажмите на Подробнее интенсивность каждого региона, представляющих интерес для всех кадров видео, и сообщить о каждом измерении в таблице. Каждая область интереса представляет собой столбец таблицы, и каждый кадр является строкой. Перенесите таблицу в программу электронной таблицы для дальнейшего анализа.
    5. Участок график с номером кадра на оси X и означает флуоресцентную интенсивность на y-оси. Номер кадра может быть преобразован во времени, используя частоту кадров (4 кадра/с) видео(рисунок 1А).
    6. Определите амплитуда сокращения мышц, оценив увеличение интенсивности флуоресценции GFP по отношению к базовому уровню. Мышечные сокращения увеличивают интенсивность GFP, поскольку они приносят больше GFP в непосредственной близости от координационного района, как больше мышц получить вытащил во время этих сокращений (Фильм 1)7. Установить базовую флуоресценцию как среднюю интенсивность между волнами сокращения. Нормализовать интенсивность GFP до базового, разделив каждое значение интенсивности окупаемое инвестиций на базовую интенсивность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый профиль имеет различные базовые флуоресценции, так как могут быть различные уровни экспрессии в различных сегментах мышц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из потенциальных осложнений является то, что флуоресценция GFP может меняться с течением времени из-за отбеливания фотографий. Это может быть решена путем мониторинга изменений в базовой флуоресценции и с использованием достаточного размера выборки для анализа волн (мы обычно используем наборы из 10 флуоресцентных волн и подтверждаем, что базовый уклад примерно постоян, принимая в среднем только те пик минима как базовый уровень, который снизился в флуоресценции на 10% или менее по отношению к первоначальному пику минимы). Импульсно-светодиодное освещение может быть также применено для смягчения этой проблемы16.
    7. Сравните мышечные сокращения на левой и правой сторонах эмбриона, проанализировав пиковую интенсивность по обе стороны эмбриона для одних и тех же сегментов. Используйте амплитуду сокращения и время пиковой интенсивности для изучения различий в степени и сроках перистальтических волн сокращения мышц, распространяющихся по обе стороны эмбриона.
    8. Сравните нормализованную интенсивность GFP в различных сегментах (например, в передних, медианных и задних областях) во время распространения волны сокращения мышц для изучения изменений в сокращении по мере распространения волны. Этот анализ также определяет направление волны (т.е., распространяется ли она на передние или задние области эмбриона).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Нормальные перистальтические сокращения мышц показаны в WT (дикий тип, Кантон-S) эмбриона в фильме 1. Средняя частота перистальтических волн мышечных сокращений в нашем анализе составила 47 сокращений в час, а средняя амплитуда была на 60% выше базового уровня для эмбрионов WT. Эмбрионпрокат показан для эмбриона WT в фильме 2, с белой стрелкой, обозначающей начальное положение трахеи, и черной стрелкой, изображающей положение придатка доза. Придаток дорста (экстерьер) не двигае...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наш метод обеспечивает количественный способ анализа важных поведения эмбрионов во время развития, таких как перистальтические волны сокращения мышц, включая периодичность волн, амплитуду и рисунок, а также волновое воздействие на подвижность эмбриона и осанку. Это может быть полезно при анализе различных мутантов для изучения роли конкретных генов в регулировании этих и других моделей поведения во время эмбрионального развития. Мы использовали изменения в интенсивности маркера GFP для анализа интенсивности сокращения мы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Проект был частично поддержан Национальными институтами здравоохранения гранты RO1 NS099409, NS075534, и CONACYT 2012-037 (S) в Вице-президент.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Цифровой фотоаппаратHamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0C13440-20CUС различными фильтрами излучения
ЩипцыFST Dumont11254-20Наконечник Размеры 0,05 мм x 0,01 мм
LEDX-cite BDX (Excelitas)XLED1
МикроскопCarl Ziess Examiner D1491405-0005-000Эпифлуоресценция с покадровой съемкой
ИглаBD 30576725 г x 1-1/2 дюйма
КистьСовременные ремеслаПодойдет любая кисть
Чашки ПетриVWR25384-16460 мм x 15 мм
Программное обеспечениеHCImage Live
Thread Zap Wax penThread Zap II (by BeadSmith) (Amazon)TZ1300Инструмент для горелки
Треугольный пластиковый стаканVWR25384-152100 мл

Ссылки

  1. Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
  2. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  3. Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
  4. Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
  5. Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
  6. Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
  7. Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
  8. Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
  9. Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
  10. Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
  11. Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
  12. Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
  13. Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
  14. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. Hames, B. D. , Oxford University Press. New York. 389(1998).
  15. Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
  16. Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Флуоресцентные маркеры мышцанализ в ImageJперистальтические волныперекатывание эмбрионаO-маннозилирование белковэпифлуоресцентная микроскопияобласть интереса
Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.