人乳头瘤病毒（HPV）RNA 色原原位杂交被认为是检测肿瘤内活性人乳头瘤病毒感染的金标准之一。该方法可实现对 HPV E6-E7 mRNA 表达的可视化，并对其信号进行定位和半定量评估。
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摘要
摘要
人乳头瘤病毒（HPV）感染是口咽部鳞状细胞癌（OPSCC）一个亚型的主要危险因素，该亚型通常比与酒精和烟草相关的OPSCC预后更好。对HPV病毒RNA进行显色原位杂交（CISH）可实现对致癌蛋白E6和E7的病毒转录本进行半定量评估，并以良好的空间分辨率进行原位可视化。该技术能够诊断出活动性感染，通过在肿瘤内HPV感染细胞中可视化HPV转录情况来实现。该技术的一个优势是可避免邻近肿瘤的非肿瘤性HPV感染细胞带来的污染。总体而言，由于其良好的诊断性能，该技术被认为是识别活动性HPV感染的金标准。由于E6和E7病毒蛋白与细胞蛋白pRb和p53的相互作用是细胞转化所必需的，因此HPV RNA CISH在功能上具有相关性，能准确反映活动性致癌性HPV感染。该技术也具有重要的临床意义，因为"低"或"高"HPV转录水平有助于在HPV相关p16阳性头颈部癌患者中识别出两个不同的预后组别。本文介绍了在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片上手动进行HPV RNA CISH的实验方案，所用试剂盒来自厂商。除了显色检测外，RNA原位杂交也可采用荧光检测方式（RNA FISH）。此外，该技术还可与传统的免疫染色联合使用。
引言
HPV RNA CISH 是一种用于检测活动性 HPV 感染的有力工具，对于口咽部或子宫颈等不同部位的良性或恶性病变的诊断可能具有关键意义。活动性 HPV 感染的检出有助于支持 HPV 诱导病变的诊断，从而影响其治疗方案和预后判断。
人乳头瘤病毒（HPV）是最常见的性传播感染，已描述超过100种病毒基因型1。从示意图上看，低危型基因型（如6型和11型）可引起生殖器疣、复发性呼吸道乳头状瘤病及其他良性病变；而高危型基因型（如16型和18型）则导致大多数宫颈癌和肛门癌，并在不同地区头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的肿瘤发生中发挥不同程度的作用，具体比例取决于区域流行病学数据2。
目前有多种工具可用于检测人乳头瘤病毒感染。由于高危型HPV感染会导致病毒致癌蛋白E6和E7的表达3，因此检测E6和E7的转录本被广泛视为识别活动性HPV感染的金标准4。HPV RNA CISH可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本上进行，而这类样本可从患有各种HPV相关疾病的患者中较为容易地获取。该方法已在宫颈、肛门和阴道的鳞状上皮内瘤变，以及宫颈、肛门和上呼吸道消化道的浸润性鳞状细胞癌中进行了性能评估5：在HPV....
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方案
本方案遵循伦理准则，并已获得伦理委员会（Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II，编号：2015-09-04）的批准。
1. 材料准备
- 1×洗涤缓冲液的配制
- 在大容量试剂瓶中加入2.94 L蒸馏水和一瓶（60 mL）50×洗涤缓冲液（见材料表），配制3 L的1×洗涤缓冲液，充分混匀。
注意：1×洗涤缓冲液可预先配制，在室温下保存最多1个月。
- 在大容量试剂瓶中加入2.94 L蒸馏水和一瓶（60 mL）50×洗涤缓冲液（见材料表），配制3 L的1×洗涤缓冲液，充分混匀。
- 复染试剂的配制
- 配制50%苏木精染液。
- 在通风橱中，将100 mL Gill苏木精I液（见材料表）加入到染色缸中的100 mL蒸馏水中。
注意：50%苏木精染色液可重复使用，最多使用1周。
- 在通风橱中，将100 mL Gill苏木精I液（见材料表）加入到染色缸中的100 mL蒸馏水中。
- 配制0.02%（w/v）氨水（蓝化试剂）。
- 在通风橱中，将1.43 mL的1 N氢氧化铵加入盛有250 mL蒸馏水的量筒或其他容器中，用石蜡膜密封容器，充分混匀3–5次。
注意：为确保实验定量准确性，必须使用氢氧化铵。试剂可预先配制，确保所有容器始终保持加盖状态。
- 配制50%苏木精染液。
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结果
如本文所述，在头颈部鳞状细胞癌中，若肿瘤细胞的细胞质或细胞核中出现棕褐色点状染色，可视为阳性病例。在大多数研究中，信号结果被判定为“阳性”或“未检出”14。已有报道采用半定量方法对信号进行评估，但不同研究团队之间缺乏标准化。例如，在某些研究中，信号评分标准为：每个肿瘤细胞出现1–3个点记为1+，4–9个点记为2+，10个或以上点记为3+6；在事后分析中，仅纳入更容易判读的2+和3+信号。在另一项研究中，结果被分为两个评分等级：RNA CISH“高表达”和RNA CISH“低表达”。RNA CISH“高表达”的定义为：超过50%的癌细胞呈染色阳性，或在至少30%的癌细胞中，染色区域覆盖细胞表面（细胞核和细胞质）超过80%，上述观察使用20倍物镜完成（图1）21。
关于阳性对照，PPIB信号应在20倍至40倍放大下可见为细胞核内的点状颗粒。至于阴性对照切片，每20倍显微镜视野中每10个.......
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讨论
使用市售试剂盒进行HPV RNA CISH是检测病毒转录物并指示HPV活跃感染的有力工具。该方法可手动操作，整体步骤易于遵循，且市售试剂盒使用方便。此技术可同时对19个组织学样本及一个对照玻片进行染色，检测过程约需8小时。关键在于各步骤之间切勿让样本干燥（除非另有说明）。根据所处理的组织类型，前处理条件可能需要相应调整。
HPV E6-E7 mRNA 表达信号具有精确的空间分辨率，从而排除了肿瘤邻近的HPV感染非肿瘤细胞可能带来的污染。检测HPV E6和E7 RNA具有功能相关性，因为这些转录本可通过与细胞内的p53和pRb蛋白相互作用，介导HPV诱导的细胞转化4。因此，在子宫颈癌前病变中，根据信号的定位，HPV RNA CISH有助于区分低级别鳞状上皮内病变（LSIL）与高级别鳞状上皮内病变（HSIL）：在大多数LSIL病例中，整个上皮层均可见大量弥散性染色的细胞核，提示处于病毒复制阶段；而HSIL则表现为表层有大量弥散性染色的细胞核，同时伴有基底层强阳性核内及胞浆内点状信号（此类病变既往称为CIN2），或在整个上皮层均出现强核染色.......
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披露
CB：董事会，学术研讨会：MSD、BMS、Astrazeneca、Roche
致谢
作者感谢欧洲乔治·蓬皮杜医院和内克尔医院病理科（Laurianne Chambolle、Elodie Michel 和 Gisèle Legall）；PARCC 欧洲乔治·蓬皮杜医院组织学平台（Corinne Lesaffre）；Virginia Clark 对语言的编辑；以及 Alexandra Elbakyan 的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 苏木精溶液，Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ 烤箱 (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ 载玻片架 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge 疏水屏障笔 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD 检测试剂 - 棕色 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | 该试剂盒包含扩增试剂 AMP1、AMP2、AMP3、AMP4、AMP5 和 AMP6，以及检测试剂 DAB-A 和 DAB-B |
| RNAscope 3-plex 阴性对照探针 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-plex 阳性对照探针 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H2O2 & Protease Plus 试剂 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | 过氧化氢 ×2 和 Protease Plus ×1 |
| RNAscope 探针 - HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope 靶标修复试剂 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope 洗涤缓冲液试剂 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | 洗涤缓冲液 50X ×4 |
参考文献
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?....
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重印与许可
