Method Article

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

DOI:

10.3791/59463

⸱

May 11th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוסים מופרשים על ידי בני אדם ובעלי חיים עלולים לזהם מקורות מים ולהוות סיכון לבריאות האדם כאשר מים זה משמש לשתייה, השקיה במזון, כביסה, וכו '. מחוון חיידקים בצואה קלאסית לא תמיד לבדוק את הנוכחות של פתוגנים ויראלי כך גילוי פתוגנים נגיפי אינדיקטורים נגיפי הוא רלוונטי כדי לאמץ מדדים של הקלה בסיכון, במיוחד בתרחישים הומניטאריים ובתחומים שבו התפרצויות ויראליות המועברות במים תכופים.

כיום, מספר בדיקות מסחריות המאפשרות כימות של חיידקים אינדיקטור צואה (פרפור) זמינים לבדיקה בנקודת השימוש. עם זאת, בדיקות מסחריות כאלה אינן זמינות לאיתור וירוסים. איתור וירוסים בדגימות מים סביבתיים דורש ריכוז של כמה ליטרים לתוך כרכים קטנים יותר. יתר על כן, לאחר מרוכז, זיהוי של וירוסים מסתמך על שיטות כגון הפקת חומצת גרעין וזיהוי מולקולרי (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR] מבוסס assays) של genomes ויראלי.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת ריכוז של וירוסים מ 10 דגימות מים L, כמו גם את החילוץ של חומצות גרעין נגיפי בנקודת השימוש, עם ציוד פשוט ונייד. זה מאפשר בדיקות של דגימות מים בנקודת השימוש עבור מספר וירוסים והוא שימושי בתרחישים הומניטאריים, כמו גם בכל הקשר שבו מעבדה מצויד אינה זמינה. לחילופין, השיטה מאפשרת התמקדות בווירוסים המצויים בדגימות מים והובלת הריכוז למעבדה בטמפרטורת החדר לצורך ניתוח נוסף.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך השלבים הראשונים של החירום ההומניטרי, גישה לאספקת מים נקיים, תברואה והיגיינה הם קריטיים להישרדות של אלה המושפעים. לכן, הניטור איכות המים הוא בעדיפות כדי למנוע התפרצויות המועברות במים. זה ידוע כי מים מזוהמים הוא לעתים קרובות מקור המחלות, אבל לעתים קרובות קשה לקבוע את המקורות של התפרצויות ויראלי כגון וירוס הפטיטיס (הכבד), אפילו עם זמינות של שיטות מעבדה קונבנציונאלי. השליטה על איכות המים מבוססת על כימות השקר1,2,3,4. עם זאת, הוא תועד בהרחבה כי אין מתאם בין העדר פרפור ונוכחות של פתוגנים מים ויראלי כגון רוטוירוס (רוב), norovirus (NoV), או מת<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה ואריזה

הערה: החומרים/ציוד שיש לארוז מפורטים בטבלה 1. השתמש בכפפות כדי לטפל הריאגנטים הנדרש לבקרת התהליך, ריאגנטים ריכוז, חומצות גרעין החילוץ ריאגנטים וריאגנטים לזיהוי. ללבוש משקפיים הגנה כדי להתמודד עם ריאגנטים הדרושים לחילוץ חומצת גרעין.

  1. בקרת תהליכים
    1. הכנת MS2 בקטייפרג'ה תרבות המניה (אמריקאי סוג אוסף התרבות [ATCC] 15597-B1) המכיל 1 x 1010 Pfu/mL במעבדה על ידי ביצוע הליך ISO 10705-1:199514.
    2. אז, סדרת מחלקים 10 μl של ההשעיה לכל צינור המכיל 1 x 108 pfu לתוך 10 מ"ל צינורות ולתת המים להתאדות ב 37 ° c. השתמש בשפופרת אחת לכל אחת מד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח שיטות

הליך זה פותח במעבדה של וירוסים מזהמים של מים ומזון עם שיתוף הפעולה של המלון. הוא כולל שלושה צעדים שונים. הראשון, ריכוז החלקיקים הנגיפי, הוא עיבוד של שיטת החלב המגנב שתוארה קודם לכן12,17,18. השיטה המקורית שונתה כדי להיות בלתי תלויה באספקת חשמל, פשוטה יותר וללא שלבים צנטריפוגה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה VirWaTest מאפשרת ריכוז של וירוסים וחומצות גרעין החילוץ מדגימות מים בנקודת השימוש על ידי משתמשים לא מנוסים. זהו פרוטוקול זול, מהיר ופשוט. הריכוז מבוסס על העיקרון של החיסון האורגני באמצעות חלב, שדרכו מצבם של ה-pH הנמוכים והמוליכות הגבוהה הופכים את חלבוני החלב הניגנב לתוך הרמה הנמוכה ביותר של וירוסים ספוח. כאשר המשקע משקע, קל לאסוף אותם, מה שמאפשר להתרכז 10 L של מים, ואילו הקשר המסורתי מסורתי לא יכול להתמודד עם כמויות גדולות של מים.

השיטה שונתה להיות מעשית בנקודת הדגימה מבלי להשתמש בציוד חש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוטסט היה פרויקט מחקר במימון תוכנית HIF (קרנות חדשנות הומניטארית) של ELHRA (שיפור הלמידה & מחקר לסיוע הומניטארי). המחברים מכירים בצוותי השטיפה שיתפו פעולה באדיבות במחקר זה. הניתוח של דגימות באקוודור המומן על ידי אוקספם אקוודור והבימוי הטוב ביותר באוניברסיטה דה לאס אמריקאס (AMB). BRT. 17.01). S. Bofill-Mas הוא בחור סרה-צייד באוניברסיטת ברצלונה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001כולל 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus של Solis Biodyne (תערובת qPCR), 50 תגובות
8 רצועות מיקרו-צינורות עם כובעיםdD Biolab840637פרופיל נמוך, קירות דקים, מותאמים לסוללות PCR כמותיות ואיכותיות
ומתאמי מתח לבוחש מגנטיGenIUL900011674כולל מתח לרכב 12V מתאם
תמיכת דליGenIUL900011648תמיכת אלומיניום
, 10 ליטרCater4You10LTRפוליפרופילן, עמיד בפני חבלה,
צינור צנטריפוגה בצבע שקוף, 50 מ"לLabBoxCTSP-E50-050פוליפרופילן, סטרילי, בוגר, עם חצאית
חומצת לימון 1-הידרט, 500 גרםPanReac AppliChem1410181211טהור, דרגת פארמה, 1 קילוגרם
בקבוק PET שקוףLabBoxFPET-500-088צבע שקוף, PET, פקק אינו כלול
חלב רזה Difco, 500 גרםBecton Dickinson232100מגן
DNA/RNA מיובש, 250 מ"לZymo ResearchR1100-250מדיום שימור DNA/RNA, 250 מ"ל
בקר פיפטה Easy9 LabBoxEAS9-001-0010.3 μ מסנן m, פיפטות מ-0.1 עד 100 מ"ל, מחזיק פיפטה סיליקון הניתן לחיטוי
צינור אפנדורף, 0.5 מ"לאפנדורף0030121023פוליפרופילן,
צינור אפנדורף נעילה בטוחה, 2 מ"לאפנדורף0030120094 פוליפרופילן,
צינור אפנדורף נעילה בטוחה, 5 מ"לdD Biolab999542פוליפרופילן, סטרילי,
אתנול מדורג 96% V/V, 1 ליטרPanreac AppliChem361085-1611UV, IR  ו-HPLC
LabBoxFORS-007-002קצה דק, מעוקל, L= 120 מ"מ
מערבל מגנטיGenIUL900017000מופעל על ידי סוללה
dD Biolab929203שחור, קצה עדין במיוחד, עמיד במים, ייבוש מהיר, לפלסטיק וכלי זכוכית
מיקרו רוטה-מתלה למיקרו-צינורותdD Biolab377824 מודולים, אורך x רוחב x גובה = 208 x 100 x 100 מ"מ
Mini8 PCR בזמן אמת CyclerCoyote Biosciences, סיןMini-8נייד, עובד עם ספקי כוח 12V או סוללות חיצוניות, שני ערוצים, קיבולת ל-8 צינורות
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292 ריאגנטים לעד 48 בידודים, אחסן בטמפרטורת הסביבה
פיפטה סרולוגית עם קצה פתוח, 10 מ"לDeltalab900136Nסטרילי, עטוף בנפרד (נייר / פלסטיק)
מכסה בורג PE PP28LabBoxTP28-004-020לבקבוקי PET
רצועת מחוון pHLabBoxWSPH-001-001טווח pH 2.8 עד pH 4.4, 50 רצועות לחבילה
מבחנה מפלסטיקQuimikals300913כולל מכסה
פוליאתילן פסטר פיפטהLabBoxPIPP-003-500בוגר, 7 מ"ל נפח כולל,
בקבוק בורג פוליפרופילן לא סטרילי עם מכסה בורג,Deltalab409726סטרילי, מדורג עד 100 מ"ל
בקבוק בורג פוליפרופילן עם מכסה בורג, 60 מ"לDeltalab409526Gמכסה בורג, סטרילי, מדורג עד 50 מ"ל
אבקת אבקת חומר ניקוי-סבון אבקה רגיל לשטיפת בגדים
כבלי חשמל למערבל מגנטיGenIUL900011692 חיבור בין סוללות לבוחשים מגנטיים
QuickPick כלי מגנטיBioNobile24001כלי כף יד לחלקיקים מגנטיים
טיפים לאיסוף מהיר בקופסהBioNobile24296RNase, חיטוי, 96 יחידות
QuickPick XL gDNA חלקיקים מגנטייםBioNobileSN51100 3.2 מ"ל
מלחי יםסיגמא-אולדריץ'S9883-500Gתערובת מלח מלאכותית הדומה מאוד להרכב המלחים המומסים של מי האוקיינוס
צינורות סיליקוןLabBoxSILT-006-005גליל של 5 מטרים, פנימי  ø x חיצוני  ø= 6 x 10 מ"מ
כדורי נתרן הידרוקסיד, 98.5 - 100.5%כדורי 28244295 כימיקלים VWR, 1 ק"ג
פלטפורמה סיבובית סולאריתSOL-EXPERT Group70020צלחת אקרילית, 10 סל"ד, תומכת בעד 300 גרם
SOLIScript ערכת בדיקה חד-שלביתSolis BioDyne08-57-00250כוללת את 5x One-Step Probe Mix של Solis Biodyne (qPCR Mix) ו-40x One-Step SOLIScript Mix (אנזים טרנסקריפטאז הפוך), 250 תגובות
SPEEDTOOLS ערכת מיצוי וירוס RNABioTools21.141-4197כולל מאגר BAW של BioTools (מאגר כביסה 1), מאגר BAV3 (מאגר כביסה 2 ו-3) ומאגר BRE (מאגר
SpinBar מגנט ערבוב אוקטהדרליdD Biolab045926טבעת ציר, L x  ø = 38 x 8 מ"מ,
פיפטה סרולוגית עם קצה סרט כחול, 10 מ"לDeltalabPN10E1סטרילי, עטוף בנפרד (נייר/פלסטיק)
פיפטה סרולוגית עם קצה סרט, 50 מ"לDeltalab900043סטרילי, עטוף בנפרד (נייר/פלסטיק)
Termi-DNA-Tor - מסירחומצות גרעיןBioTools22001-4291מסיר חומצות גרעין, חיידקים, פטריות ומיקופלזמה מחומר ומשטחים, 450 מ"ל
מגיב לביולוגיה מולקולרית של מים, 1LSigma-AldrichW4502-1Lללא נוקלאז ופרוטאז, 0.1 μ m שקית
Whirl-Pak מסוננת, 540 מ"לDeltalab200361תיק רגיל תחתון יציב
LabBoxBZIP-080-100פוליאתילן, L x W = 120 x 80 מ"מ
דלי עבור פינצטה מעבדה סמן מכסה בורג 150 מ"ל, סילוק).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manua....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Virus DetectionWater SamplesViral ConcentrationNucleic Acid ExtractionPoint of UseVirWaTest MethodMagnetic ParticlesPCR AssaysHuman AdenovirusesMS2 Control

Related Articles