Здесь мы представляем протокол, который упрощает измерения света вызвали сравнительно ответов от личинок данио рерио. Роман конусообразной Губка наконечник электрода может помочь сделать изучение визуальной разработки в личиночной данио рерио, используя сравнительно Эрг проще для достижения надежных результатов и низкой стоимости.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сравнительно запись в личиночной данио рерио, с помощью Роман конусообразной Губка наконечник электрода
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Данио рерио (Danio рерио) обычно используется как позвоночных модель развития исследований и особенно подходит для визуального нейронауки. Для функциональных измерений визуального исполнения Эрг (ЭРГ) является идеальным неинвазивный метод, который был хорошо установленных в высших позвоночных видов. Этот подход все чаще используется для изучения зрительной функции в данио рерио, в том числе на ранних стадиях развития личинок. Однако наиболее часто используемые записи электрод для личинок данио рерио Эрг на сегодняшний день является Стеклянный электрод микропипеткой, которая требует специализированного оборудования для его производства, бросая вызов для лабораторий с ограниченными ресурсами. Здесь мы представляем протокол Эрг личиночной данио рерио, используя конусообразные Губка наконечник электрода. Роман электрод легче производства и ручкой, более экономично и меньше шансов повредить личиночной глаз, чем микропипеткой стекла. Как ранее опубликованные Эрг методы текущий протокол может оценить внешней функции сетчатки через фоторецептор и биполярных клеток ответов, a - и b волны, соответственно. Протокол можно четко иллюстрируют уточнение зрительной функции на протяжении раннего развития личинок данио рерио, поддерживая Утилита, чувствительность и надежность Роман электрода. Упрощенная электрод особенно полезна при создании новой системы Эрг или модификации существующих малых животного ERG аппарат для измерения данио рерио, помогая исследователям в визуального нейронауки использовать данио рерио модели организма.
Введение
Данио рерио (Danio рерио) стала широко используемых генетических позвоночных модели, включая исследования визуального нейронауки. Растущая популярность этого вида можно объяснить преимущества, включая легкость генетической манипуляции, высоко сохранены позвоночных зрительной системы (нейрон типы, анатомические морфологии и организации и базовой генетики), высокая плодовитость и более низкая стоимость животноводства, по сравнению с млекопитающих модели1. Неинвазивная сравнительно (ЭРГ) уже давно клинически используется для оценки человеческой зрительной функции и в лабораторных условиях для количественного определения видения в ряде кру....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все сравнительно (ЭРГ) процедуры выполнялись согласно положениям австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета кодекса практики для ухода и использования животных и были утверждены Комитетом по институциональной этики животных на Университет Мельбурна.
1. буфер подготовка
- Подготовка 10 x буфер Золотая рыбка Рингера (1,25 М NaCl, 26 мм KCl, 25 мм CaCl2, 10 мм MgCl2, глюкозы 100 мм, 100 мм HEPES) с использованием обратного осмоса (RO) воды. Настроить буфер рН 7,8 и стерилизовать буфер с помощью фильтра 0.22 мкм. Магазин 10 x буфер при 4 ° C как решение штока3
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот раздел предоставляет представителя результаты для Эрг измерений ежедневно от 4 до 7 dpf. От 4 dpf Эрг ответы свидетельствуют надежные компоненты a - и b волны, которые возникают от фоторецепторных клеток и биполярных клеток, соответственно. В каждом возрасте протестированы амплитуда волны b увеличилось с интенсивности света (рис. 2; Рисунок 3). В частности чувствительности личиночной данио рерио сетчатки для диммера вспышки увеличивается.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Функциональные устройства индикации как Эрг стали все более важное значение в набор инструментов, используемых для изучения личиночной данио рерио8,9,12,14. Из-за небольшого размера глаза личиночной данио рерио стекло micropipettes была адаптирована как запись электродов в наиболее опубликованные протоколы3,4,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы имеют не раскрытия информации, имеющих отношение к этой работе.
Благодарности
Финансирование этого проекта была оказана грант от Мельбурнский Институт неврологии (PTG, PRJ и BVB).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 & микро; m фильтр | Millex GP | SLGP033RS | Фильтры 10× золотая рыбка звонок буфер для стерилизации |
| 1 мл шприц | Terumo | DVR-5175 | с 30G × ½ Иглой следует добавить капли физиологического раствора на кончик губки электрода, чтобы предотвратить высыхание и повышенный шум в сигналах ЭРГ. |
| 30 G × ½ " игла | Terumo | NN*3013R | Для добавления солевого раствора с сопнговым наконечником электрода. |
| Биоусилитель | ADInstruments | ML135 | Для усиления сигналов ЭРГ. |
| Раствор отбеливателя | Кинг Уайт | 9333441000973 | Для альтернативного метода хлорирования ленточным электродом. Действующее вещество: 42 г/л гипохлорита натрия. |
| Циркуляционная водяная баня | Lauda-Koönigshoffen | MGW Lauda | Используется для изготовления водогрейной платформы. |
| Электродный провод | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum кабели для подключения электродов серебряной проволоки к усилителю. |
| Фотометрическое решение Faraday Cage | International | Для поддержки адаптации темноты и включения установки Ganzfeld для улучшения соотношения сигнал/шум. | |
| Ганцфельдская чаша | фотометрическое решение International | Специально разработанный светостимулятор: диаметр 36 мм, размер апертуры 13 см. | |
| Luxeon светодиоды | Phillips Light Co. | Для стимуляции света двадцать светодиодов мощностью 5 Вт и один светодиод мощностью 1 Вт. | |
| Микроманипулятор | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Удерживает регистрирующий электрод во время экспериментов. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft версии 2010 | Программа для анализа электронных таблиц. | |
| Увлажняющий гель для глаз | GenTeal Gel | 9319099315560 | Используется для покрытия личинок рыбок данио во время записи во избежание обезвоживания. Действующее вещество: 0,3 % гипромеллоза и 0,22 % карбомер 980. |
| Пастеровская пипетка | Copan | 200C | Используется для бережного переноса личинок данио-рерио. |
| Система сбора данных Powerlab | ADInstruments | ML785 | Управляет светодиодами для генерации стимулов. |
| Губка ПВА | MeiCheLe | R-1675 | Для размещения личинок рыбок данио и изготовления конусообразного электрода из |
| солевого раствора | Aaxis Pacific | 13317002 | Для гальванического покрытия электрода из серебряной проволоки. |
| Программное обеспечение | Scope ADInstruments | версии 3.7.6 | Одновременно запускает стимул через систему Powerlab и собирает данные |
| Серебро (тонкая круглая проволока) | A & E металл | 0,3 мм | Используется для изготовления записывающих и эталонных электродов ЭРГ. |
| Стереомикроскоп | Leica | M80 | Используется для придания формы и измерения конусообразной вершины губки (с масштабной линейкой на окуляре). Размещается в клетке Фарадея для установки электродов. |
| Трикаин | Sigma-aldrich | E10521-50G | Для обезболивания личинок данио-рерио. |
| Платформа с водяным подогревом | , изготовленная по индивидуальному заказу | Для поддержания температуры губчатой платформы и тела личинки во время записи ERG |
Ссылки
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
