刷状细胞是存在于正常小鼠气管中的稀有胆碱能化学感受上皮细胞。由于其数量有限，通过离体方法评估其在气道免疫和重塑中的功能作用具有挑战性。本文介绍了一种通过流式细胞术分离气管刷状细胞的方法。
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摘要
摘要
气管刷状细胞是一类胆碱能化学感受上皮细胞，能够将来自气道腔内的信号传递至免疫系统和神经系统。它们属于一类化学感受上皮细胞家族，该家族还包括肠黏膜中的簇细胞、气管中的刷状细胞，以及鼻黏膜中的孤立化学感受细胞和微绒毛细胞。不同上皮区域的化学感受细胞共享关键的细胞内标志物和核心转录特征，但也表现出显著的转录异质性，这可能反映了局部组织微环境的差异。为了深入定义这些稀有上皮细胞的功能，需要从单细胞悬液中分离气管刷状细胞，但其分离具有挑战性，可能由于气管刷状细胞与神经末梢之间存在紧密相互作用，或与气道特异性的紧密连接和黏附连接组成有关。本文介绍了一种从小鼠气管上皮分离刷状细胞的操作流程。该方法首先将气管上皮与黏膜下层分离，从而使得上皮层后续仅需较短时间的木瓜蛋白酶孵育。该方案为活体气管刷状细胞的流式细胞分选及功能分析提供了一种快速且便捷的解决方案。
引言
刷状细胞属于一类化学感受上皮细胞，其特征是表达苦味受体以及味蕾细胞中所见的味觉受体信号转导机制。与味蕾细胞不同，化学感受上皮细胞散在分布于上皮表面，在鼻上皮中被称为孤立化学感受细胞（SCCs）和微绒毛细胞1,2，在气管中称为刷状细胞3,4，在肠道中称为簇状细胞5,6。表达苦味受体及苦味信号转导机制的上皮细胞也存在于尿道7,8和咽鼓管9中。气道刷状细胞在神经源性和免疫性气道反应中具有独特功能。它们是可产生乙酰胆碱的化学感受细胞，在受到苦味化合物以及群体感应物质等细菌代谢产物激活时，可诱发保护性呼吸反射10。气道刷状细胞也是气道上皮中白细胞介素-25（IL-25）的主要来源，而IL-25可调控气道内由气源性变应原引发的2型炎症反应3。
由于气管上皮中下呼吸道刷状细胞数量较少，....
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方案
在开展以下实验之前，须确保所有动物护理、使用及操作规程均已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定。 "实验动物护理和使用的指南" (8th 版本，2011）及ARRIVE指南。 以下所述所有操作程序均已通过布莱根妇女医院机构动物照护与使用委员会的审查与批准。
1. 试剂的准备
- 配制Dispase消化液，即含16 U/mL Dispase和20 µg/mL DNase I的PBS溶液。确保Dispase粉末完全溶解后，再将溶液置于37 °C水浴中预热。
- 向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入5%热灭活的胎牛血清（FBS），配制终止液。
- 配制 Tyrode I 缓冲液：向不含钙的 HEPES-Tyrode 缓冲液中加入 26 U/mL 木瓜蛋白酶（48 U/mg 木瓜蛋白酶溶液，20 µL/mL）和 10 µL/mL L-半胱氨酸。
- 制备Tyrode II缓冲液：向含钙的HEPES-Tyrode缓冲液中加入2 μL/mL亮抑蛋白酶肽（5 mg/mL）。
- 配制FACS缓冲液：使用不含钙、镁的Hanks' Balanced Salt Solution（HBSS） & 酚红，添加....
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结果
该方案已成功用于分离气管刷状细胞以进行RNA测序3。在分离气管并采用两步法消化组织后（图1），排除死细胞（使用PI染色）后收集细胞，并用荧光标记的CD45和EpCAM进行染色。根据前向散射和侧向散射特征排除双联体细胞后，我们将刷状细胞定义为CD45低表达/阴性、EpCAM阳性且eGFP阳性的细胞（图2A）。通过流式细胞术分析，刷状细胞约占CD45low/neg细胞的0.16–0.42%，每根气管可获得250–600个刷状细胞（图2B）。我们将这些计数结果与基于ChAT(BAC)-eGFP小鼠全气管铺片中ChAT-eGFP阳性细胞数量的估计值进行比较，该估计值来源于我们已发表的对气管刷状细胞的广泛免疫组织化学评估3，并在本文中加以展示（
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讨论
我们发现，采用高剂量分散酶处理40分钟，随后进行短时间木瓜蛋白酶处理（30分钟），是气管消化和刷状细胞分离的最佳方案。与其他替代方案相比，该组合既能避免过度消化，又能获得最高的刷状细胞得率。
虽然传统上提取肺部造血细胞依赖于胶原酶IV等温和的消化酶15，但上皮细胞的分离则需要更复杂的方案。由于上皮细胞之间以及上皮细胞与基底膜之间存在紧密连接和黏附连接，且细胞本身较为脆弱，因此更难获得单细胞悬液。大多数上皮细胞消化方案包含两个步骤： 第一步是将上皮层从基底膜上分离，随后通过进一步步骤破坏使上皮细胞彼此黏附的紧密连接和桥粒16,17。
多个研究团队已成功采用两步法分离肠上皮细胞的不同改良方案，分离出肠道中的化学感应簇细胞：第一步使用EDTA和DTT将上皮细胞从黏膜下层释放，随后用dispase消化上皮细胞片层。Howitt等人采用5 mM EDTA加1 mM.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢布里格姆妇女医院人类免疫学中心流式细胞术核心实验室的 Adam Chicoine 在流式细胞分选方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目包括 R01 HL120952（N.A.B.）、R01 AI134989（N.A.B.）、U19 AI095219（N.A.B.、L.G.B.）和 K08 AI132723（L.G.B.）；同时获得美国过敏、哮喘和免疫学会（AAAAI）/美国肺部过敏性呼吸系统疾病奖（N.A.B.）、AAAAI 基金会教职员工发展奖（L.G.B.）、Steven 和 Judy Kaye 青年创新者奖（N.A.B.）、Joycelyn C. Austen 女性医师科学家职业发展基金（L.G.B.）以及 Vinik 家族的慷慨捐赠（L.G.B.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>抗体 | |||
| 抗GFP（多克隆山羊Ig） | Abcam | 货号 ab5450 | |
| APC 抗小鼠 CD326（EpCAM） (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC 标记的大鼠 IgG2a, k 同型对照 | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| 驴抗山羊IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| 正常山羊 IgG | R&D Systems | 货号#AB-108-C | |
| 太平洋蓝染料标记的抗小鼠 CD45 抗体（30F-11） | Biolegend | cat#103126 | |
| 太平洋蓝染料标记的大鼠 IgG2b, k 同型对照 | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX（抗小鼠 CD16/32）抗体 | Biolegend | cat#101320 | |
| 化学品、多肽和重组蛋白 | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | 货号# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’不含钙的 s 缓冲液（10 mM HEPES，135 mM NaCl，2.8 mM KCl，1 mM MgCl₂）2，12 mM NaHCO₃3，0.4 mM NaH2PO4，0.25% BSA，5.5 mM 葡萄糖。使用18.2兆欧姆水配制，并通过0.22微米滤膜过滤 µm 滤膜 | Boston BioProducts | 货号# PY-912 | |
| Tyrode’s 溶液（HEPES 缓冲）140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂2，2 mM MgCl2 和 10 mM 葡萄糖。使用 18.2 兆欧水配制，并通过 0.22 微米滤膜过滤 µm 滤膜。) | Boston BioProducts | 货号 BSS-355 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma | 货号 C7352 | |
| 亮抑蛋白酶肽三氟乙酸盐 | Sigma | 货号 L2023 | |
| 木瓜乳胶中的木瓜蛋白酶 | Sigma | cat# P3125 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | cat# P4170 | |
| <强>实验模型：生物体/品系 | |||
| ChATBAC-eGFP（B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J） | 杰克逊实验室 | 7902 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 配备 Airyscan 共聚焦系统的 LSM 800 在 蔡司Axio Observer Z1倒置显微镜 | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| <强>一次性设备 | |||
| 1.5 mL 无菌管 | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底管，12 mm × 75 mm 规格 | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL 聚丙烯锥形管，30 mm × 115 mm 款式 | Falcon | 352098 | |
| 12号一次性羽毛手术刀 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| 培养皿，100 mm × 15 mm 型号 | Falcon | 351029 | |
| 无菌细胞筛，100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
参考文献
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M.
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