ひと臍帯血由来 cd34 陽性造血幹細胞の体外増幅+細胞を用いたバルプロ酸

サマリー

ここで、ex は説明 cd34 陽性から造血幹細胞の体外増幅⁺臍帯血由来の細胞は、サイトカイン カクテルとバルプロ酸の併用治療します。このメソッドは、いずれかのプリミティブの HSCs の体外増幅のかなりの程度につながる臨床または実験室。

要約

臍帯血 (UCB) 単位は、同種骨髄移植が必要な患者のひと造血幹細胞 (造血) の代替ソースを提供します。UCB では、いくつかのユニークな利点がありますが、UCB の各ユニット内の HSCs の限られた数は、再生医療での使用と大人で HSC 移植を制限します。Ex vivo CD34 の培養により機能人間 HSCs の効率的な拡張を可能⁺細胞 Ucb から分離と脱アセチル化酵素阻害剤、バルプロ酸 (VPA) と扱われる。ここで詳細なプロトコルを記述する培養条件および CD34 を急速に分離の方法論⁺細胞し、プリミティブの HSCs のプールの高度に拡張します。拡張の HSCs は短期および長期生着を確立することができる、すべての種類の分化した造血細胞に上昇を与えることができます。このメソッドは、自家 HSC 遺伝子治療の臨床応用の可能性を保持しても、遺伝子の編集に関連付けられた機能の HSCs の損失を克服するために魅力的なアプローチを提供します。

概要

臍帯血から造血幹細胞 (造血) の体外増幅 (UCB) 単位は再生医療や移植療法の HSC のアプリケーションのための大きい約束を保持します。UCB ユニットで移植が簡単なコレクション、高可用性、感染リスクを最小限、病気再発のリスクが低い、移植片対宿主病 (GVHD) の低周波などいくつかのユニークな利点。しかし、臨床現場での使用の主要な欠点は HSCs 各 UCB ユニット¹内の限られた数です。移植片拒絶反応や異常免疫再構築のリスク、造血回復遅延生着 HSCs 結果の不十分な数。

現在、様々 な方法と戦略は、前のヴィヴォ Ucb の HSCs の限られた数を拡大する開発されています。低分子や化合物の生体内培養 ex と異なるサイトカイン カクテルの組み合わせが様々 な角度で HSC 番号^{2,3,4,5,6、拡張の結果します。 7,8}。重要なは、ex vivo 文化条件は急速な細胞増殖、代謝活動の増加、プライマリ HSCs を定義するプリミティブの特性の損失につながるストレスを誘発します。したがって、プライマリ原始造血に近い特性を持つ機能の HSCs の偉大な数の拡大につながる発展途上のプロトコルが必要です。

CD34 の無血清培養⁺細胞および Ucb から分離されたプリミティブ HSCs^4,9,10の多数の拡張のバルプロ酸 (VPA) 結果で治療します。Ucb から派生した既存の HSCs の増殖のためにもっぱらは HSC 拡大しません。代わりに、この拡張は、細胞の分裂と増殖⁹.の限られた数と組み合わせて原始的な表現型の取得により、します。サイトカインとバルプロ酸、CD34 の組み合わせと孵化の初期の 24-48 時間以内⁺細胞トランスクリプトームと長期的な造血を特徴づける形質のプロファイルを取得します。HSCs のパーセントの大幅な増加は HSCs (バルプロ酸治療の 24 時間以内の 63 倍)⁹数のプロンプトの増加を伴います。特に、バルプロ酸 ex vivo 拡大戦略は、低代謝活動で、原始的な特徴をさらに強調する HSCs を展開します。

ここで説明したメソッドを提供条件といずれかのプリミティブの HSCs の体外増幅のかなりの程度まで導く治療臨床または実験室。バルプロ酸治療と組み合わせたサイトカイン カクテル ex vivo 拡大戦略を使用します。バルプロ酸は、双極性障害と他の神経疾患の治療のための FDA の承認薬です。バルプロ酸と HSC 拡大はプロンプトと操作の時間および汚染のリスクを最小限に抑え、7 日以内に発生します。重要なは、このプロトコルは、長期的な HSC 表現型マーカー CD90 など CD49f バルプロ酸⁹による治療の後 24-48 時間以内の取得できます。このプロトコルで作成された拡張の HSC 移植すべて造血細胞系統に分化し、次 myeloablated NSG マウスへの移植長期生着を確立できるので、造血系を再生成する能力があります。モデル⁴。また、このプロトコルは再現性の高い、現実的な CD34 を効率的で迅速な分離できます⁺細胞 Ucb、この手順の工業化のために重大であります。

Ex vivo 拡張プロトコル バルプロ酸も遺伝子¹¹を編集中に発生する HSCs の大幅な損失を克服するために可能性があります。遺伝子編集サイクリング細胞および DNA 修復機構の活性化に必要なサイトカインへの露出が必要です。バルプロ酸治療のプロンプトの効果により、このメソッドはに関連して現在期間内遺伝子組み換え細胞数が高い世代は、遺伝子の修正のプロトコルを利用するため有益にかもしれない。

プロトコル

Ex vivo 拡張プロトコル HSC マウントサイナイ医科大学の研究倫理委員会のガイドラインに従います。

1. バッファーとメディアの準備

1. 分離バッファー CD34 の分離前に 24 h の準備⁺細胞 UBCs から 2 mL 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、7.5% の 33 mL を追加してウシ血清アルブミン (BSA) バッファー 465 mL 生理食塩水 (1 x PBS)。穏やかに混合し、4 ° C で一晩バッファーを維持
2. 浄化の日の室温で暖かいメディア。

2. UCB ユニットから単核細胞 (多国籍企業) の分離

1. 75 cm²フラスコに UCB ユニット全体を調剤します。希釈し、優しく、UCB を室温で PBS の等量に混ぜてください。
2. (50 mL の円錐管 35 mL 希釈 UCB の処理に使用することができます 1 つ) UCB ユニット全体を処理するために必要な管の数を決定します。各管に密度勾配メディア (材料の表を参照してください) の 15 mL を追加し、2 つのレイヤーを作成する密度勾配メディア上に希釈した UCB を分配します。
   注:非常にゆっくりと、UCB で密度勾配メディア層の混合を防ぐために 45 ° の角度でチューブを押しながら希薄の UCB を調剤します。
3. 加速と減速率が低い、30 分 400 × gで遠心分離機します。遠心分離の後プラズマ密度勾配メディア層間白い層 (バフィー コート) で多国籍企業を探します。
4. ゆっくりとバフィー コート層を乱すことがなく、プラズマの 2/3 を吸い出しなさい。新しい 50 mL のチューブにバフィー コート層を慎重に転送します。25 mL に達するまで 50 mL のチューブに同じ UCB の単位からのすべての多国籍企業を収集します。収集された多国籍企業のボリュームは 25 mL を超えている場合は、新しいチューブを使用します。
5. 多国籍企業の 25 mL を含むチューブに冷 PBS の 25 mL を加え、よく混ぜます。400 x gで 4 ° C で 10 分間遠心
   注:冷 PBS は細胞表面の抗体のキャッピングを防止し、非固有のラベルを削減することが重要です。
6. 慎重に上清を吸引し、優しく再冷 PBS の 50 mL の細胞ペレットを中断します。
7. カウントの細胞懸濁液の 20 μ L を削除します。アクリジン オレンジ/propidium ヨウ化自動化された細胞カウンターを用いた染色で染色細胞数を数えます。多国籍企業の合計数を計算します。
   注:細胞数は、トリパン ブルー排除法、検定によっても実行できます。
8. 400 x gで 4 ° C で 15 分間遠心
   注:すぐに必要ない場合多国籍企業はこの段階で冷凍することができます。

3. 分離 CD34 の Ucb から細胞の⁺

1. CD34 を準備⁺抗体結合 CD34 の隔離のための磁気ビーズ ソリューション⁺細胞分離バッファーの多国籍ミックス 300 μ L 人間 FcR ヒト IgG (ブロッキング試薬) を 100 μ l 添加し、CD34 CD34 の隔離のための磁気ビーズの 100 μ L⁺ごとの 10 の⁸の多国籍企業からの細胞。Cd34 陽性数の増加の分離から細胞の⁺ (> 10⁸) 多国籍企業、試薬をそれに応じてスケール アップ。
2. 慎重にステップ 2.8 で遠心管から上清を吸引します。3.1 (10 の⁸セルごと 500 μ L のソリューションを使用する) 準備した CD34 磁気ビーズ ソリューションでペレットを再懸濁します。
3. 穏やかに混合し、, 4 ° C、30 分で。
   注:細胞分離装置の準備 (材料表参照) 潜伏期間中。製造元の指示に従って、作業バッファーのストレージ ソリューションを置き換えるし、洗浄プログラムが続く洗濯プログラムを実行します。
4. チューブが完全に塗りつぶされるまで細胞の混合物を含んでいる管にバッファーを実行して冷たいセル区切り記号を追加します。400 x gで 4 ° C で 15 分間遠心
5. 上清を吸引し、バッファー (2 mL/10⁸セル) を実行している冷たいセル区切りで細胞ペレットを再懸濁します。15 mL チューブに細胞懸濁液混合物 2 mL を転送します。
6. 15 mL チューブの 3 セットを読み込むセルの区切り記号のラックが 4 ° C で prechilledチューブの 1 つのセットを含む多国籍企業、負の分数を収集に使用するチューブの 2 番目のセットとチューブの 3 番目のセットは、精製 CD34 を収集するために使用されます⁺細胞。
7. 細胞分離装置にラックを読み込み、 posseld2のプリセット プログラムを実行します。
   注:セル区切りデバイス¹²を置き換える手動マグネットセパレーターを利用する別の方法を使用できます。
8. 4 ° C で 15 分間 400 x gで正の分数と遠沈管上清を吸引し、精製 CD34 を再懸濁します 1 mL の無血清培地で細胞の⁺ 。
9. アクリジン オレンジ/propidium ヨウ化自動化された細胞カウンターを使用して染色のセルをカウントします。
   注:すぐに必要ない場合は、CD34 を精製した⁺細胞はこの段階で冷凍することができます。

4. 精製⁺の UCB-cd34 陽性細胞の体外増幅 Ex バルプロ酸

1. プレートに精製 CD34 メディアの十分な量を準備⁺細胞 3.3 10 セル/mL の⁴倍の密度で。培地組成は血清の自由な文化媒体 10 μ L/mL ペン/連鎖球菌があり、150 ng/mL 幹細胞因子 (SCF)、100 ng/mL fms のようなチロシンキナーゼ受容体 3 (FLT3 リガンド) 100 ng/mL トロンボポエチン (TPO) 補足 (材料の表を参照してください)、50 ng/mL インターロイキン (IL-3) 3。
2. プレート精製 CD34 12 ウェル プレートで細胞の⁺ (5 × 10⁴ CD34⁺細胞/メディアの 1.5 mL/も) と 37 ° c 5% CO₂加湿インキュベーターで培養。
3. 分離 CD34 の純度を評価する⁺細胞と細胞組成 FACS 解析による下記のよう手順で 6.3。
4. サイトカイン カクテルで 16 時間処理細胞の培養に 1 mM の最終的な集中にバルプロ酸を追加します。
5. 5% CO₂加湿インキュベーターで 37 ° C でさらに 7 日間培養します。
   注:メディアの元の期間中は変更されません体外増幅。

5 フローサイトメトリー解析のため染色抗体

1. 2 x 10 の⁴–6 × 10⁴セルと戦略をゲーティング FACS を決定するアイソタイプ ソリューションを汚し、非固有のバインディングのレベルを決定する抗体染色液を準備します。(1/100 APC 抗 CD34, 1/200 FITC アンチ CD90) 抗体とそれぞれのアイソタイプを分離バッファーの 50 μ L に希釈 (分離バッファーの組成はステップ 1.1 で定義される)。
   注:戦略をゲーティング FMO 各抗体と細胞の単一染色を実行します。合計抗体補償ビーズ キットは、補償セットアップに使用することができます (材料の表を参照してください)。
2. 複数回のピペッティングにより細胞培養を均質化します。1.5 mL チューブに細胞とピペット 5 x 10 の⁴セルをカウントします。
3. 室温で 15 分間 400 × gで遠心分離バッファーの 1 つの mL を追加します。
4. 上清を吸引、染色液を 50 μ l 添加でペレットを再懸濁します。細胞部屋の温度で 30 分間インキュベートします。
5. 室温で 15 分間 400 × gで遠心分離バッファーの 450 μ L を追加します。
6. 上清を吸引し、分離バッファーを 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。FACS 解析を実行するまで、少なくとも 5 分間氷の上の細胞を保ちます。実行可能なセルをゲートに 7 aad 1 μ L を追加します。
7. FACS マシンで染色細胞サンプルをロードし、最低流量でセルを取得します。
8. 各 fluorophore のアイソタイプ コントロールと FITC (CD90)、APC (CD34)、PerCP/Cy5.5 (7 AAD) 染色にゲートを設定する単一の染色細胞を分析します。
9. PerCP/Cy5.5 負率とプロット APC 対可能な CD34 の割合を判断する FITC をゲート⁺、CD90⁺、および CD34⁺CD90⁺文化で HSPC/HSC 人口を定義するセル。

6. 流れ Cytometry 細胞選別の染色抗体

1. 複数回のピペッティングにより拡張された細胞を再懸濁します。セル数をカウントし、15 mL や 50 mL チューブに全体の文化を転送します。
2. 冷たい分離バッファーを持つ管を埋める
3. 400 x gで 4 ° C で 15 分間遠心
4. 5 x 10 の⁵– 2 × 10⁶セルを汚す抗体染色液と 1 x 10 の⁵セルを汚し、FACS ゲート決定アイソタイプ ソリューションを準備します。希釈 1/10 (APC 抗 CD34)、1/20 (FITC CD90) 抗体と分離の 500 μ L に対応するアイソタイプは各条件ごとバッファーします。
5. 製造元の指示に従って合計抗体補償ビーズ キットを使用して単一の色補正コントロールを準備します。
6. 5.2 から新しいチューブに上清を転送し、37 ° C でそれを維持この培地は、並べ替えられた細胞の培養に再利用されます。
7. 冷たい分離バッファー、濃度が 5 × 10 の⁵細胞で細胞ペレットを再懸濁します/mL。その他 1.5 mL チューブに 1.5 mL チューブ アイソタイプの汚損のための 1 x 10 の⁵セルとソートされます残りのセルを転送します。
8. 4 ° C で 15 分間 400 x gでチューブを遠心分離します。
9. 上澄みを廃棄し、ソリューションと染色液抗体で並べ替えられます細胞のペレットを染色のアイソタイプの細胞のペレットを再懸濁します。
10. 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
11. 4 ° C で 15 分間 400 × gで遠心分離バッファーの 450 μ L を追加します。
12. 2 mL の冷たい分離バッファーでペレットを再懸濁します。
13. 下駄を防止するには、FACS まで 40 μ m セル ストレーナーと氷の場所を介してサンプルをフィルターします。
14. 正しいパラメーターを使用した並べ替えのセルソーターをセットアップします。
15. アイソタイプ サンプル セット電圧と前方のゲインと側方散乱と蛍光の否定的な人口を識別するを実行します。
16. 実行の単一の色補正係数を設定し、適用するコントロールは、パラメーター コレクションのプロトコルを補償しました。
17. ゲートの戦略を確立する (Ab) サンプル (~ 50,000 イベント) の小さい因数を実行します。
18. CD34 を収集する並べ替え判定を設定⁺ CD90^-細胞画分。
19. 並べ替えセル コレクション チューブ 2 mL 分離バッファーでコーティングします。
20. 並べ替え後、セルをカウントし、4 ° C で 15 分間 400 × gで遠心分離機のこと
21. 上澄みを廃棄し、5.5 3 × 10⁴セル/mL の最終濃度に到達するためのステップでリカバリ メディアでペレットを再懸濁します。
22. CD34 をプレート⁺ CD90^- 1.5 mL 中/井戸 12 ウェル プレートで細胞を精製 (5 × 10⁴ CD34⁺ CD90 メディア/井戸の^-細胞/1.5 mL)。
23. メディアを含んでいるセルの 50 μ L を使用して FACS 解析によって純度を評価します。
24. CD34 の文化を扱う⁺CD90 1 mM 最終濃度でバルプロ酸と^-細胞。
25. 37 ° c 5% CO₂加湿インキュベーターで孵化させなさい。

結果

ここで説明されているプロトコル前のヴィヴォ プリミティブ HSCs CD34 から生成された数の増加⁺ Ucb (図 1) から分離した細胞。CD34 のプライミング⁺サイトカイン カクテル、16 h のための細胞バルプロ酸による治療によって後に追加 7 日間は、HSC の拡張のすばらしい程度の 。HSCs CD34 によって定義される表現型の拡大された細胞のプールの非常に富む非常に、⁺CD90⁺マーカー。カクテルのサイトカインを単体で扱う文化で有核細胞 (Tnc) の総数はサイトカイン カクテルと VPA (図 2 a) 培養では観察細胞数より有意に高かった。数、多国籍企業数の増加にもかかわらず、サイトカインを受けて文化の HSCs のカクテルだけで低いままサイトカイン カクテルと VPA (図 2 b) ...

ディスカッション

ここで、急速にかなりの程度まで Ucb から機能人間 HSCs の数を拡大するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用してパイロットと速度論的研究が示す、前のヴィヴォ拡張セルは速やかに獲得・ CD90 プリミティブ HSC 代謝特性⁹などいくつかの HSC 形質マーカーの発現を維持します。

この ex vivo 拡張プロトコルは比較的単純で信頼性の高いです。CD34 の精製⁺細胞細胞分離装置 (材料の表を参照) は単離細胞の迅速なリカバリを可能にする高い再現性で急速に。このメソッドは精製 CD34 の高収率の結果⁺細胞 (> 90%)手動原因菌分離に関係なく。さらに、この ex vivo 拡張プロトコルは特別な複雑なデバイスまたは大量のサイトカイン^3,13を添加した新鮮なメディアの継続的な供給を必要とする培養システムなどは不要です。し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
増殖培地	Sigma-Aldrich	Stemline II 幹細胞増殖培地 S0192-500ML
AO/PI (アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム) 生細胞/死核細胞用染色液。	ネクセロム	CS2-0106-25mL
APCマウス抗ヒトCD34クローン581	BD BIOSCIENCE	555824
APCマウスIgG1、&κ;アイソタイプコントロールクローン MOPC-21	BD BIOSCIENCE	555751
autoMACS リンス液	MACS Miltenyi Biotec	130-091-222
BD Falcon 15 mL チューブ	BD Biosciences	352097
BD Falcon 5 mL ポリスチレン丸底チューブ	BD Biosciences	352063
BD Falcon 50 mL チューブ	BD Biosciences	352098
ウシ血清アルブミン溶液	Sigma-Aldrich	A8412
CD34 MicroBead Kit、cd34ビーズとfcrブロッキング試薬、ヒト	を含む Miltenyi Biotec	130-046-703
セルアナライザー	BD Biosciences	FACS Canto II
セルアナライザーおよびソーター	BD Biosciences	FACS Aria II
セルカウンター	Nexcelom	Cellometer Auto 2000 セル生存率カウンター
セルセパレーターデバイス	autoMACS Pro セパレーター Miltenyi Biotec
Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-PD100-002
密度勾配培地	GE Healthcare Bio-Sciences AB	17-1440-03
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	Sigma-Aldrich	E8008-100ML
FITC 抗ヒト CD90 (Thy1) クローン 5E10	BIOLEGEND	328108
FITC マウス IgG1, κアイソタイプ・コントロール(FC)抗体	BIOLEGEND	400109
倒立顕微鏡
PBS	Corning cellgro	21-040-CV
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15140122
組換えヒトFlt-3 リガンドタンパク質	R&D Systems	308FKN
組換えヒト IL-3 タンパク質 (IL-3)	R&D Systems	203-IL
組換えヒト SCF タンパク質	R&D Systems	255-SC
組換えヒトトロンボポエチンタンパク質 (TPO)	R&D Systems	288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit	Thermofisher	A10497
臍帯血	胎盤血プログラム	http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
バルプロ酸ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	P4543

ニューヨーク血液センターの