والهدف من هذا البروتوكول هو النمط الجيني لداء النعمان البحر نيماتوستيلا vectensis أثناء التطفل دون التضحية بالجنين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR للنمط الجيني للجنين مرحلة gastrula من الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis دون التضحية بحياة الحيوان. بعد الإخصاب في المختبر وإزالة هلام، يسمح zygotes لتطوير لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula. ثم توضع أجنة غازترولا على سرير جل أغاروز في طبق بيتري يحتوي على مياه البحر. تحت المجهر تشريح، يتم استخدام إبرة التنغستن لفصل جراحيا جزء من الأنسجة الأبال من كل جنين. ثم يسمح للأجنة بعد الجراحة بالشفاء ومواصلة النمو. يتم استخراج الحمض النووي الجينومي من جزء الأنسجة المعزولة واستخدامه كقالب لPCR خاص بالموقع. ويمكن تحديد النمط الجيني على أساس حجم منتجات PCR أو وجود/عدم وجود منتجات PCR الخاصة بالأليل. ثم يتم فرز الأجنة بعد الجراحة وفقا للنمط الجيني. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة وتمكن من تحليل الأنماط الظاهرية أثناء التنمية.
المقدمة
يمثل الكنيداريون مجموعة متنوعة من الحيوانات التي تشمل قنديل البحر والشعاب المرجانية وشاطئ النعمان البحري. وهي ثنائية الخلايا، تتكون من ectoderm وendoderm التي يتم فصلها بواسطة مصفوفة خارج الخلية (mesoglea). Cnidaria هي مجموعة شقيقة لspeciose Bilateria، والتي نماذج الحيوانات التقليدية مثل دروسوفيلا وموس تنتمي1. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد أن الاختلاف Cnidaria-Bilateria قد حدث في فترة ما قبل الكمبري2. وعلى هذا النحو، فإن الدراسات المقارنة للسكانيين والبلاتيريين ضرورية للحصول على رؤى في بيولوجيا أسلافهم المشتركين الأحدث. في الآونة الأخيرة، كشفت علم الجينوم المقارن أن cnidarians وbilaterians حصة العديد من الجي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحريض التفريخ، والإخصاب في المختبر، وإزالة هلام
- الحفاظ على vectensis Nematostella في مياه البحر مع ملوحة من 12 أجزاء في الألف (ppt) في الظلام في 16 درجة مئوية، وتغذية Artemia يوميا.
- في اليوم السابق للتفريخ التعريفي، ضع الحيوانات في حاضنة تعمل بدرجة الحرارة والضوء. برنامج الحاضنة بحيث تتعرض الحيوانات إلى 8 ح من الضوء في 25 درجة مئوية. اختياري: إطعام قطعة صغيرة (<1 مم3)من المحار للالحيوانات الفردية قبل وضعها في الحاضنة لتعزيز التفريخ.
- ترك الحيوانات في الحاضنة لمدة 1 ساعة في 16 درجة مئوية.
- إزالة الحيوانات من الحاضنة وتركها على سطح مقاعد البدلاء مع الضوء في درجة حرارة الغرفة (RT) للسماح تفرخ.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
جينوم نيماتوسلا لديه موضع واحد أن ترميز بروتين السلائف لGLWamide neuropeptide. وقد تم الإبلاغ عن ثلاثة أليليس متحولة بالضربة القاضية في هذا المكان(glw-a,glw-b,وglw-c) سابقا5. أربعة ذكور heterozygous تحمل أليل البرية من نوع (+) وخروج المغلوب أليل GLW-cفي موقع GLWamide (النمط الجيني: +/glw-c)عبرت مع أنثى heterozygous تحمل أليل البرية وخروج المغلوب مختلفة allele gl.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR إلى النمط الجيني لجنين النعمان البحر واحد دون التضحية الحيوان. بعد التفريخ وإزالة هلام، يسمح للبيض المخصبة أن تتطور إلى gastrulae. تتم إزالة المنطقة الأبالة لكل جنين غازيولا جراحيا، ويستخدم الأنسجة الأبوروفال المعزولة لاستخراج الحمض النووي الجيني اللاحقة، في حين أن الأجنة المتبقية بعد الجراحة تلتئم وتواصل التطور. ثم يتم استخدام مقتطفات gDNA لإجراء فحص PCR لتحديد النمط الجيني لكل جنين. هذه الطريقة تستفيد من قدرة النصفين الفمويين من جنين النعمان البحري على تنظيم وتطوير10
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.
شكر وتقدير
نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم على النسخة السابقة من المخطوطة، التي حسنت المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل بأموال من جامعة أركنساس.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ذبابة الفاكهة بلتيير حاضنة مبردة | شلاب | SRI6PF | تستخدم في تحريض التفريخ |
| ملح البحر الفوري للمحيط | المحيط | 138510 | |
| أكياس الروبيان المالح | Aquatic Eco-Systems، Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| شاكر مداري قياسي ، موديل 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl ، 1 متر ، درجة حموضة 8.0 | جودة بيولوجية | 351-007-01 | |
| كلوريد البوتاسيوم | VWR | BDH9258 | |
| EDTA ، 0.5 متر pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | بديل Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 | K البيولوجي الأمريكي | N3500 | |
| (20 مجم / مل) ، ThermoFisher بدرجة الحمض النووي | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| حامل إبرة تشريح دقيق | Roboz | RS-6060 | |
| إبرة تشريح التنغستن | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة | نيو إنجلاند BioLabs | M0530L | |
| dNTP مزيج | نيو إنجلاند BioLabs | N0447L | |
| GLWamide التمهيدي | 5'- CATGCGGAGACCAAGCCAAGGC-3 ' | ||
| التمهيدي العكسي الخاص ب glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3' | ||
| التمهيدي العكسي الخاص ب glw-c < / sup>< / em> | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3' |
المراجع
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
