急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析
この記事について
サマリー
要約
健康なマウスとMLL-AF9によって駆動されるAMLを有するマウスから、様々な生きた骨髄(BM)由来の幹および前駆細胞集団におけるミトコンドリアROSを分析するためのフローサイトメトリックアプローチを提示する。具体的には、健康または白血病BM細胞がミトコンドリアスーパーオキシドを検出するフルオロゲン性色素で最初に染色され、続いて使用されるフルオロクロム結合モノクローナル抗体による染色を行う2段階の細胞染色プロセスについて説明します。様々な健康で悪性の前駆体集団を区別する。また、フローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に関する戦略も提供しています。プロトコル全体は、3-4時間の短い時間枠で行うことができます。我々はまた、フローサイトメトリーによるフルオロゲン染料を用いた生造血および白血病の幹および前駆体のミトコンドリアコンパートメントにおけるROS産生のモニタリングの利点と限界を考慮すべき重要な変数を強調する。.さらに、ミトコンドリアROSの豊富さが、明確な健康なHSPCサブ集団と白血病前駆体の間で変化するデータを提示し、血液学的研究におけるこの技術の可能な応用について議論する。
概要
活性酸素種(ROS)は、分子酸素由来の反応性の高い分子です。ROS産生の最も明確に定義された細胞位置はミトコンドリアであり、酸化リン酸化(OXPHOS)中に電子輸送鎖(ETC)を通過する電子が特定の形成につながる分子酸素によって吸収されるスーパーオキシド1と呼ばれるROSの種類。スーパーオキシドジスムターゼまたはSODと呼ばれる一連の酵素の作用を通じて、スーパーオキシドは過酸化水素に変換され、その後、カタレーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)などの酵素によって水に中和されます。ROS調節機構の摂動は、多くの場合、高分子損傷(すなわち、DNA、タンパク質、脂質)などの有害で潜在的に致命的な細胞の結果を有する酸化ストレスと呼ばれるROSの過剰産生につながる可能性があります。さらに、酸化ストレスは、糖尿病、炎症性疾患、老化および腫瘍2、3、4などのいくつかの病理に関連している。酸化ホオスタシスを維持し、酸化ストレスを防ぐために、細胞は様々なROS調節機構を有する5.
特定のROSの生理学的レベルは、適切な胚および成人のヘマトポエシス6に必要である。....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
このプロトコルに記載されているすべての動物の手順は、フォックスチェイス癌センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:プロトコルワークフローは図1に示すように4つの部分に分かれており、必要な試薬は材料の表に記載されています。
1. 骨髄(BM)分離
注:MLL-AF9白血病マウスは、前述の11として生成された。
- 前述の12、13、14、15、野生型C57.Bl6マウス(CD45.2先天性マーカーを発現する)およびC57から、単核骨髄細胞を回収する。MLL-AF9発現白血病細胞(CD45.2+)で移植したBl6-SJLマウス(CD45.1前生細胞を発現する)。
注:BMは、12、1....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
提示されたのは、複数の健康およびMLL-AF9発現白血病前駆体のミトコンドリアにおけるROSを分析する方法である。図 1は、4 つの主要なステップで構成されるプロトコル ワークフローの概略図を示します: 1) マウスからの BM 分離;2)ミトコンドリアROS、特にスーパーオキシドを認識するフッ素色素でBM細胞を染色する。3)様々な健康および白血病血化集団を線引きする表面マーカー抗体染色;そして4)フローサイトメトリーの獲得と分析。
図 2A,Bは、健康で白血病BMにおける様々な造血幹細胞および前駆体集団を分析するための代表的なゲーティング戦略を示す。破片を除去するために FSC/SSC プロットが適用され、FSC 領域 (FSC-A) 対 FSC 高さ (FSC-H) プロットを使用して、二重子と凝集体を除外します。系統表面マーカー(表1およびステップ3.1)のパネルは、リンパ球、赤血球、顆粒球.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ROSの検出のために開発されたフルオロゲン染料は、フローサイトメトリー22により顕微鏡検査または生細胞中の固定細胞において頻繁に評価される。ミトコンドリアROSフルオロゲン染料を用いてBM細胞内のミトコンドリアROSのフローサイトメトリック評価には2つの大きな利点があります:1)生細胞分析に適した高速かつ簡単な技術であり、2)希少な区別と分析を可能にします。表面マーカー染色を使用してBMの単一細胞レベルでの集団。ここで提示されるステップバイステッププロトコルは、正常なマウスとフローサイトメトリーを用いたMLL-AF9によって駆動されるAMLのマウスモデルと同様に、造来性幹および前駆体集団の外生性レドックスステータスを研究するために開発された。このプロトコルの実行中に考慮する必要がある重要な技術的変数がいくつかあります。
第一に、プロおよび抗酸化コントロールの使用は、ユーザーがミトコンドリアROS染色の増加のためのベースラインを確立するだけでなく、染色の特異性を可能にする。ここで提示されたプロトコルについては、プロオキ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
この研究は、フォックスチェイス癌センター理事会(DDM)、米国血液学会学術賞(SMS)、米国癌学会RSG(SMS)および国防総省(賞#:W81XWH-18-1-0472)によって支援されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 熱不活化 FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | メディア |
| ペニシリン ストレプトマイシン | コーニング | 30-002-CI | メディア |
| PBS | フィッシャーサイエンティフィック | BP399-20 | バッファー |
| 15 mL コニカルチューブ | BD ファルコン | 352096 | 組織培養 |
| 50 mL コニカルチューブ | BD ファルコン | 352098 | ティッシュカルチャーサプライ |
| 40 μm細胞ストレーナー | フィッシャーサイエンティフィック | 22-363-547 | 組織培養用品 |
| RBC溶解バッファー | フィッシャーサイエンティフィック | 50-112-9751 | 組織培養用品 |
| メナジオン亜硫酸水素ナトリウム | シグマアルドリッチ | M5750 | 酸化促進 |
| 剤NAC | シグマアルドリッチ | A7250 | 抗酸化剤 |
| CD3 PE-Cy5クローン 145-2c11 | バイオレジェンド | 100310 | 抗体 |
| CD4 PE-Cy5 クローン RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | 抗体 |
| CD8 PE-Cy5 クローン 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | 抗体 |
| CD19 PE-Cy5 クローン 6D5 | Biolegend | 115510 | 抗体 |
| B220 PE-Cy5 クローン RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | 抗体 |
| Gr1 PE-Cy5 クローン RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | 抗体 |
| Ter119 PE-Cy5 クローン Ter-119 | Biolegend | 116210 | 抗体 |
| CD48 PE-Cy5 クローン HM48-1 | Biolegend | 103420 | 抗体 |
| CD117 APC-Cy7 クローン 2B8 | Biolegend | 105825 | 抗体 |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | 抗体 |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | 抗体 |
| CD34 FITC クローン RAM34 | BD Bioscience | 553733 | 抗体 |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | 抗体 |
| MitoSOX赤 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | M36008 | 染料 |
| Mitotracker グリーン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | M7514 | 染料 |
| ライブ/デッド イエロー染料 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | L34967 | 染料 |
参考文献
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
