ここでは、狂犬病ワクチンにおける免疫原性糖タンパク質の内容を決定するための間接的ELISAサンドイッチ免疫キャプチャについて説明する。この試験は、中和モノクローナル抗体(mAb-D1)を使用して、糖タンパク質三量体を認識します。生産中のワクチン効力の一貫性に従うin vivo NIH試験の代替手段である。
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この記事について
サマリー
要約
動物福祉に対する世界的な懸念の高まりは、製造業者と国立管理研究所(OMCLs)が、実験動物実験の交換、削減、改良のための3R戦略に従うことを奨励しています。狂犬病ワクチンの効力を評価するためのNIHテストの代替として、IN vitroアプローチの開発はWHOおよびヨーロッパレベルで推奨されています。狂犬病ウイルス(RABV)粒子の表面では、糖タンパク質の三量体は、ウイルス中和抗体(VNAbs)を誘導する主要な免疫原を構成する。中和モノクローナル抗体(mAb-D1)が糖タンパク質の三量体形態を認識するELISA試験は、ワクチンバッチの産生と共に天然の折り畳まれた三量体糖タンパク質の内容物を決定するために開発された。このインビトロ効力試験は、NIH試験との良好な適合性を示し、RABVワクチンメーカーおよびOMCLによる共同試験に適していることが判明した。動物の使用の回避は、近い将来に達成可能な目的です。
提示される方法は、トリメリックRABV糖タンパク質のIII(aa330〜338)の抗原部位を認識するmAb-D1を用いた間接的ELISAサンドイッチ免疫キャプチャ、すなわち免疫原性RABV抗原に基づいている。mAb-D1はワクチンバッチに存在する糖タンパク質三量体のコーティングおよび検出の両方に使用される。エピトープは、その立体構造特性のために認識されるため、潜在的に変性糖タンパク質(免疫原性が低い)をmAb-D1で捕捉して検出することはできません。試験されるワクチンをmAb-D1で感作したプレートでインキュベートする。結合した三量体RABV糖タンパク質は、再びmAb-D1を添加することによって同定され、ペルオキシダーゼで標識され、次いで基質およびクロモゲンの存在下で明らかにされる。試験ワクチンと基準ワクチンについて測定した吸光度の比較により、免疫原性糖タンパク質含有量の測定が可能になります。
概要
50年以上にわたり、NIH試験1は、バッチ放出前に狂犬病ワクチンの効力を評価するための金標準法として使用される。この検査は、ワクチンを用いたマウス群の腹腔内免疫を含み、その後14日後に狂犬病ウイルス(CVS)株のチャレンジウイルスウイルス(RABV)で脳内(IC)チャレンジが行われる。効力は、ICチャレンジを生き残ったマウスの割合から評価されます。WHO2および欧州薬局方3はワクチンの効力を評価するためにNIH試験を必要としますが、このテストはいくつかのハードルに苦しんでいます:結果は非常に可変的です。感染性RABVは挑戦の間に使用され、これは技術的なスキルと厳格なバイオセーフティ対策の両方を必要とします。多数の動物が使用され、挑戦の重大度は深刻な倫理的懸念を提起する5.この検査のあまり深刻なバリエーションが開発されました:腹膜内免疫の2週間後、マウスはICによって挑戦されるのではなく、リンビトロ中和試験を使用して血清中の特定のRABV中和抗体(VNAbs)の存在について血を流し、テストされます。しかし、この試験では、既に獣医ワクチン6,7に使用されており、ヒトワクチン8に対して検討されているが
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プロトコル
1. セキュリティ対策
注:この方法は、ライブRABVと不活性化ワクチンの両方に適用可能です。
- 良い実験室の練習と安全手順を使用してください。
- 使い捨てコート、手袋、マスク、眼鏡など、適切な個人保護具(PPE)を着用してください。
- 生きたウイルスが滴定される場合は、クラスIIの生物学的安全キャビネットを使用してください。
- サンプルに接触する物質(試薬、洗浄液など)を感染物質として考えてみましょう。
- 除染のために30分間漂白剤溶液(次亜塩素酸ナトリウムの2,5%)に浸漬して汚染された物質を処理します。
- 良い実験室の練習に従って化学薬品を扱う。
2. 準備
- 可能な限り分析グレード試薬を使用してください。
- コーティングバッファー/炭酸塩バッファー、パッシベーション バッファー、希釈液およびクエン酸バッファー (表1)、フィルターを通して 0.45 または 0.22 μm フィルターを使用し、使用前の 1 日 4 °C で分析純度を維持するために保存する新しいソリューションを準備します。
- 試薬を室温(+18°C~+25°C)まで使用する30分前に、使用前に穏やかな混合で均質化します。....
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結果
以下の例では、参照ワクチンLot 09は、ウイルス粒子(PVワクチン株)の精製不活性化狂犬病からなる、使用されている。この中の糖タンパク質三量体(10 μg/mL)含有量は、ウイルスタンパク質の全量の測定(BCA試験)およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による糖タンパク質の割合の評価の後に確立されました。あるいは、校正された基準ワクチン、例えば、WHO第6国際基準(IS)狂犬病ワクチン(NIBSCコード:07/162)を用いることができる。
表3は、典型的な実験に対するOD値(492nm)を示す。これらの値を用いて、基準ワクチン曲線は、(1)垂直軸上の基準ワクチンの異なる希釈(線形スケール)で平均OD(ブランクの平均ODを差し引いた)をプロットすることによって描かれた。(2)水平軸上の糖タンパク質三量体(ng/mL)の濃度(対数スケール)(図1)。.......
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ディスカッション
mAb-D1によって認識されるエピトープは、VNAbsの誘導に対して免疫性だけでなく、神経の活性化にも関与するRABV糖タンパク質の抗原部位IIIに位置するが、病原性40、41,41および受容体認識42にも関与する。糖タンパク質に沿って別の重要な抗原部位があり、部位II43は、mAb-WI-111235など、いくつかのMAbsが単離されている。これらは同様のタイプの実験でも使用できる。
ELISAによるこのインビトロ法の1つの制限は、試験される狂犬病ウイルス株上で使用されたmAbによって認識されるエピトープの必要な保存に存在する。これまで、ヒト狂犬病ワクチンに使用されるすべての古典的な株は、mAb-D1によって認識されています。動物ワクチンに使用される狂犬病株の多様性が高いほど、将来的に問題になる可能性があります。しかしなが.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
シルヴィ・モルゲオー博士とジャン=ミシェル・チャップサル博士は、ワクチンバッチに関するELISAアッセイを確立し、国際的なワークショップや共同研究を組織するために、彼らの主要な参加を認められなければなりません。原稿を批判的に読んでくださったサブリナ・カリに感謝します。ピエール・ペラン博士は、mAb-D1の分離と特性評価を担当しました。この作品は、主にパスツール研究所の資金調達によって支援されています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| クラスII生物学的安全キャビネット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10445753 | 生ウイルスを滴定する場合 |
| クリアフラットボトムイムノ非滅菌96ウェルプレート、400 & マイクロ;L、MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | 装填された抗体への結合に適しています |
| Equip Labo ポリプロピレン研究所 ヒュームフード | ThermoFisher Scientific | 12576606 | 硫酸の調製に適しています |
| 免疫学プレート Strong 吸着 MAXISORP フラットボトム ウェル F96 | Dutscher | 55303 | 装填された抗体への結合に適しています |
| マイクロプレートシーリングテープ(100枚) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15036 | |
| マイクロプレート シングルモードリーダー サンライズ | TECAN | ||
| マイクロプレートシェイカーインキュベーター | ダッチャー | 441504 | |
| マイクロプレートウォッシャー ウェルウォッシュ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 5165000 | |
| マルチチャンネルピペット (30-300 µL) 12 チャンネル | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| シングルチャンネルピペット (キット 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μLマイクロ、2-20 μL、20-200 μL&100-1000 ΜL) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 4700880 |
参考文献
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
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再版と許可
