يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد

7.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59647

⸱

يوليو 11, 2019

 ,  ,  , 
1School of Brain and Behavioral Science, Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

في هذه المقالة

ملخص

تحدث التغيرات المورفولوجية في الخلايا الليفية المتجاوبة المناعية بعد التنشيط وتعزيز التعديلات في التوظيف الخلوي. استخدام التصوير بفوتونين بالاقتران مع بروتين خاص بالفيبلاف 1 (FSP1) من الفوتونات وراثياً؛ tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) خط الماوس والأخضر الفلورسنت الموسومة lipopolysaccharide-FITC، يمكننا أن نوضح استيعاب محددة للغاية من lipopolysaccharide في الخلايا الليفية الجلدية والتغيرات المورفولوجية في الجسم الحي.

الملخص

الخلايا الليفية هي الخلايا mesenchymal التي تغير مورفولوجيا عند التنشيط، مما يؤثر في نهاية المطاف على البيئة الدقيقة للأنسجة التي تقع فيها. على الرغم من أن تقنيات التصوير التقليدية مفيدة في تحديد تفاعلات البروتين ومورفولوجيا في الأنسجة الثابتة، فإنها ليست قادرة على إعطاء نظرة ثاقبة حول مدى سرعة الخلايا قادرة على ربط وكمية البروتينات، ومرة واحدة تنشيط كيف يتغير مورفولوجيا في فيفو. في هذه الدراسة، ونحن نسأل 2 الأسئلة الرئيسية: 1) ما هو المسار الزمني لتنشيط الخلايا الليفية عن طريق تأثير مثل مستقبلات-4 (TLR4) وتفاعل lipopolysaccharide (LPS) و 2) كيف تتصرف هذه الخلايا مرة واحدة تفعيلها؟ باستخدام التصوير 2-فوتون، قمنا بتطوير تقنية جديدة لتقييم قدرة LPS-FITC لربط مستقبلات الكونات، TLR4، وأعرب عن الخلايا الليفية الطرفية في خط الماوس مراسل الوراثية. FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox في الجسم الحي. هذا النهج الفريد يسمح للباحثين لخلق أشرطة الفيديو المتعمقة، الفاصل الزمني و / أو صور من البروتينات التفاعل مع الخلايا الحية التي تسمح للمرء أن يكون مستوى متزايد من الحبيبية في فهم كيف يمكن للبروتينات تغيير السلوك الخلوي.

المقدمة

Lipopolysaccharide (LPS) هو إندوتوكسين موجود في الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبية الغرام1. LPS لديه تقارب ملزم عالية لمستقبلات مثل الرسوم 4 (TLR4)/CD14/MD2 مستقبلات مجمع2. TLR4 هو مستقبلات التعرف على نمط وجدت عادة على الغشاء الخارجي لمجموعة واسعة من الخلايا المناعية, الخلايا mesenchymal, ومجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية3,4,5. يؤدي تنشيط TLR4 المعبر عنه على الخلايا المناعية إلى أنظمة رسول ثانية معتمدة على MyD88 ومستقلة، وتنتهي بنقل بيتا كابا العامل النووي (NFיB) إلى نواة الخلية. وهذا يسبب الخلية المناعية prototypic لإنتاج وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل إنترلوكين (IL)-1β، IL-6، و TNF-α6. ومع ذلك, كيف تستجيب أنواع الخلايا الأخرى لتحفيز TLR4 ليست واضحة كما. وقد تورطت الخلايا الليفية في مجموعة واسعة من الأمراض مثل السرطان والتليف الكيسي، وقد ثبت مؤخرا أن تلعب دورا monocyte العلاج الكيميائي الجذب وتعزيز التهاب7،8،9.  يهتم مختبرنا بدور الخلايا الليفية في تطوير الألم الحاد والمزمن، حيث تشير الأدلة المبكرة إلى أن العوامل التي تطلقها الخلايا الليفية (مصفوفة metalloproteinases (MMPs)، مثبطات الأنسجة من metalloproteinases (TIMPs)، والخلايا الليفية عوامل النمو (FGFs)) تشارك في الألم العصبي10.

يمكن تحديد حالات تنشيط الخلايا من خلال مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل: تحريض الجينات الفورية المبكرة، وتغيير التعبير البروتيني، وانتشار الخلايا، والتغيرات المورفولوجية11،12،13. هناك العديد من التقنيات الموجودة للإجابة على الأسئلة التي قد تكون لدينا حول كيفية تنشيط الخلايا يساهم في الأمراض، ولكن لديهم جميعا قيودها. يستخدم الكيمياء المناعية النمطية الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتسمية البروتينات ذات الأهمية في الأنسجة الثابتة، والتي قد تكون غير محددة وغالبا ما تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرة قبل أن تسفر عن نتائج مثمرة14. النشاف الغربي هو تقنية مفيدة عند مقارنة مستويات التعبير البروتين في أنسجة ما بعد الوفاة. ومع ذلك، فإن العنصر النسيجي يفتقر إلى هذه التقنية والباحثين غير قادرين على تحديد أي تغييرات في مورفولوجيا15. RNA-Seq يسمح لنا لتحديد كمية وجود RNA رسول في عينة التي في كثير من الحالات تسفر عن بيانات ثاقبة. ومع ذلك، فإن الفجوة بين النسخ والترجمة يجعل من الصعب أن يكون القرار الزمني بعد التحفيز16. التصوير البؤري مفيد في تحديد التعبير والتعريب المشترك للبروتينات الموجودة في مقطع عرضي من الأنسجة17. في كثير من الأحيان، وهذا لا يمثل كامل عينة الأنسجة. وعلى النقيض من ذلك، تسمح المجاهر متعددة الفوتونات للمستخدمين بتصوير ما يقرب من 1 مم في عمق العينة، وخلق تمثيل شامل ثلاثي الأبعاد18. لذلك، نختار التركيز على في الجسم الحي، 2-الفوتون التصوير الإعدادية، والبيانات التي تم جمعها من هذه التجارب هي أكثر مباشرة ذات الصلة إلى البيئة الدقيقة البلاستيكية للغاية ومترابطة من الأنسجة الحية.

ميزة دراسة التفاعلات مستقبلات البروتين في الجسم الحي هو أننا يمكن أن التقاط بوضوح كيف تستجيب الخلايا لتحفيز, في الوقت الحقيقي, في بيئتهم الأصلية دون تأثير ضار وغير متوقع لاستخراج الأنسجة بعد الوفاة19. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء دراسات طولية لتقييم اللدونة الخلوية وفتيلة التي قد تحدث بسبب التنشيط.  باستخدام التصوير 2-فوتون، ونحن الحفاظ على سلامة البيئة الدقيقة موجودة عند تطبيق التحفيز الخارجي. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد الاستفادة من الجزيئات في الخلايا الليفية بعد الحقن المحيطي من LPS الموسومة بشكل فلوري على مدى عدة ساعات في الجسم الحي ودور TLR4 في تنشيط الخلايا الليفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل جامعة تكساس في دالاس المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة.  وقد أجريت جميع التجارب باستخدام الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8-12 أسبوعا ولدت في المنزل على خلفية C57BL/6. تم شراء الفئران المعدلة وراثيا مع الكري-recombinase مدفوعة من قبل المروج البروتين-1 محددة الليفية تجاريا (جاكسون، 012641) (FSP1cre)+/- وعبرت مع tdTomatolox-stop-lox الفئران، كما تم شراؤها تجاريا ( جاكسون, 007914) و ([فسب1كر])+/- ; tdTomatolox-stop-lox and FSP1cre-/-; ولدت tdTomatolox-stop-lox الفئران في المنزل على خلفية C57BL/6 (الشكل1A، B،C). البروتين الليفي الخاص 1 هو بروتين داخلي يعبر عنه على ما يقرب من 72٪ من الخلايا الليفية ويمثل سائق الكري فعالة في الأنسجة الجلدية20. وكانت الفئران تؤوي مجموعة وأعطيت إمكانية الحصول على الغذاء والماء. تم الحفاظ على درجة حرارة الغرفة عند 21 ± 2 درجة مئوية. في حين استخدمنا C57BL/6 عبرت الفئران الذكور والإناث في 8-12 أسابيع، ونحن لا نعتقد أن العمر، الجنس، أو الخلفية الوراثية هي المتطلبات اللازمة لتشغيل التجارب متعددة الفوتونات. تم التخدير العميق للفئران مباشرة بعد التجربة وقتلوا.

1- تحضير المخدرات

  1. إعداد حل 5 ميكروغرام/20 ميكرولتر من الليبوبوليساكاريد-فيتك (انظر جدولالمواد) في PBS معقمة 1X (درجة الحموضة 7.4). دوامة حل الأسهم في كثافة متوسطة لمدة 30 ثانية الحد الأدنى لضمان خلط متجانسة لتركيز متساو في جميع أنحاء الحل قبل الأنابيب (LPS هو جزيء الدبق).
    ملاحظة: لا تضع LPS في حاوية زجاجية، إذا كان ذلك ممكناً، استخدم أنابيب الطرد المركزي الصغير السيليكونية. يُحفظ على الجليد حتى يُستعمل.

2. التصوير الإعداد

  1. قم بإعداد النظام متعدد الفوتونات (راجع جدولالمواد) للتصوير بلونين. وهذا يتطلب استخدام ليزرين منفصلين للإثارة (انظر جدولالمواد)، ومجموعة مكعب فلتر GFP/RFP (انظر جدول المواد)، وهدف غمر المياه بـ 25 x (1.05 NA) (انظر جدولالمواد).
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين تغيير هذه الإعدادات لتناسب بشكل أفضل الإعدادات البديلة وقدرات المجهر multiphoton. هذه هي المعلمات المستخدمة في البروتوكول التجريبي. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محددة.
  2. وضع جهاز مجسم (انظر جدولالمواد) على خشبة المسرح من المجهر متعدد الفوتون. توصيل هذا إلى آلة تسليم التخدير (انظر جدولالمواد) لضمان تخدير الحيوانات لمدة التجربة. ضع قطعة من الورق الأسود غير اللامع على سطح الجهاز كنقطة اتصال لمخلب الماوس.
  3. حدد الماسح الضوئي الرنانة مع منطقة مسح ثابتة من 512 ميكرومتر × 512 ميكرومتر.
    ملاحظة: لا تقم بإجراء التجارب في هذا البروتوكول باستخدام الماسح الضوئي مقياس الجلفانومتر. بسبب معدل العينة أبطأ، سيكون هناك تشويه في z-كومة أشرطة الفيديو الفاصل الزمني بسبب التنفس من الحيوان الذي لا مفر منه.
  4. ضبط الليزر الإثارة اثنين إلى الأطوال الموجية الإثارة من GFP وRFP، 930 نانومتر و 1100 نانومتر على التوالي، وتوجيه مسار الضوء من كل من الليزر الإثارة إلى هدف واحد باستخدام مرآة dichroic من 690-1050 نانومتر السماح ليزر الإثارة 930 nm ضبطها أن تنعكس على الماسح الضوئي الرئيسي والليزر 1100 نانومتر ضبطها لتمريرمباشرة إلى الماسح الضوئي الرئيسي (الشكل 2).
    ملاحظة: من الممكن تغيير هذه الأطوال الموجية الإثارة استناداً إلى إعداد المستخدم.
  5. تعيين قوة الليزر من FITC إلى 5٪ وGFP إلى 20٪.
    ملاحظة: يوفر هذا الإعداد نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية (SNR) في هذه التجارب. الكشف عن إشارة عن طريق أنابيب متعددة القلويات ومضاعف ة للصورة (PMTs)؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أجهزة الكشف GaAsP بدلاً من ذلك في تجارب عالية الحساسية جداً.
  6. إعداد غرفة للتصوير في ظل ظروف مظلمة دون ضوء طائش.

3. في التصوير الحي

  1. ضع الماوس في غرفة الحث في نظام توصيل التخدير واستخدم 5% من الأيسوفلوران (انظر جدولالمواد) بمعدل تدفق الأكسجين 2 لتر/دقيقة لوضع الماوس تحت التخدير العميق.
    ملاحظة: من المستحسن للغاية ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التجربة.
    1. نقل الماوس إلى جهاز مجسممع مع الوصول إلى مخروط الأنف للحفاظ على التخدير طوال التجربة. خفض isoflurane إلى 1.5٪ -2٪ والحفاظ على معدل التدفق ثابت.
    2. تثبيت بقوة مخلب الخلفية إلى قطعة من الورق الأسود مع الشريط الأسود على المناطق القريبة والبعيدة على حد سواء إلى منطقة الاهتمام (وهذا يقلل من آثار التنفس الماوس على جودة الصورة)، والتأكد من سطح الأخمص من مخلب هو دون عائق وتواجه حتى نحو الهدف. تأكد من أن رأس الماوس مستقر داخل مخروط الأنف المرفقة بالجهاز.
      ملاحظة: مراقبة الماوس عن أي علامات الشدة أو الجفاف طوال التجربة وضبط isoflurane وفقا لذلك.
  2. وضع كمية سخية من زيوت التشحيم المعقمة القائمة على المياه (هلام، انظر جدولالمواد) على سطح الأخمص من مخلب ولمس الهدف لذلك من أجل خلق عمود من السائل بين مخلب والهدف.
  3. استخدم ضوء الإثارة FITC للتركيز في الطبقة الجلدية من الكف. تأكد من أن يتم تصور الخلايا الليفية الموسومة tdTomato قبل الاستمرار في (هذه الخطوة مهمة في تحديد المستوى البؤري الصحيح إلى الصورة).
    ملاحظة: الطبقة الجلدية من مخلب حوالي 100-150 ميكرومتر في مخلب.
  4. صورة منطقة الخلايا الواقعة تحت سطح الأخمص من مخلب الخلفية مع كل من 930 نانومتر و 1100 نانومتر ضبطها الليزر والحصول على 15 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي 5-10 z-شرائح في حوالي 1 ميكرومتر لكل شريحة لإنشاء تمثيل للبيئة قبل حقن مع LPS-FITC.
  5. إجراء حقن داخل البلنطاتر من 5 ميكروغرام /20 ميكروغرام LPS-FITC على مخلب الماوس الخلفي باستخدام 25 ميكرولتر زجاج هاميلتون حقنة (انظر جدولالمواد) وإبرة 30G (انظر جدولالمواد)، مع الحرص على عدم إزعاج موقف مخلب.
  6. صورة منطقة من الخلايا تقع مباشرة تحت سطح الأخمص من مخلب الخلفية مع كل من 930 نانومتر و 1100 نانومتر ضبطها الليزر والحصول على 60-120 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي 5-10 z-شرائح في ما يقرب من 1 ميكرومتر لكل شريحة لتحديد استيعاب LPS-FITC من قبل الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في البداية، حقننا LPS-FITC في الكف الخلفي من الفئران البرية من أجل تصور استيعاب LPS-FITC في جميع أنواع الخلايا الموجودة في الطبقة الجلدية من مخلب. بعد أن لاحظت عددا لا يحصى من الخلايا في الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية الاستفادة من الفلورسنت الموسومة LPS في فأر ة نوع البرية (فيديوالشكل 1،2)، حاولنا استهداف الخلايا الليفية على وجه التحديد لأنها هي التركيز الرئيسي في أبحاثنا. قبل تصوير الكفوف من الحيوانات حقن مع LPS-FITC أردنا أن نكون واضحين أنه لا يوجد الفلورة المتأصلة في الخلايا في طبقة الجلد. هذا هو لضما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن القول أن أهم الخطوات في الجسم الحي 2-فوتون التصوير هي: 1) اختيار الماوس مراسل الوراثية الحق والبروتين الفلورسنت الموسومة لإعداد الفوتون متعددة والاحتياجات التجريبية21،22؛ 2) تصوير المستوى البؤري الصحيح ليكون لها تمثيل دقيق لسكان الخلايا في الأنسجة23؛ 3) التقليل من الحركة بسبب الحيوان المعطلة بشكل غير صحيح24؛ و4) اختيار متى لتحليل البيانات نوعيا مقابل كميا25،2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يتم اعتماد هذا العمل بواسطة منحNS096030 (MDB). كما نود أن نشكر مدير التصوير الأساسي فيد براكاش. كما نود أن نشكر مركز أوليمبوس ديسكفري/ مرفق التصوير الأساسي في يو تي دالاس على توفير المعدات والدعم

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x PBS ، 4 لترFisherbrandBP3994
700 Series MICROLITER محاقن ، هاميلتون ، موديل 705 LT حقنةهاميلتون80501
BD إبرة انزلاقية دقيقة 30GVWR305106
وسادة زرقاءمكعب مرشح فيشربراند1420665
: أخضر / أحمر (BP 495-540 DM570 BP 575-645)أوليمبوسFV30-FGR
Isoflurane ، USP 250 ملVedco50989-150-15
عديد السكاريد الدهني من الإشريكية القولونية O111: B4 - FITC المترافقSigma-AldrichF3665-1MG
ليزر الماسح الضوئي الرئيسي: Spectra Physics INSIGHT DS + -OL ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي ، قابل للضبط من 680 نانومتر إلى 1300 نانومتر ، عرض نبضة 120 fs في مستوى العينةأنابيب الطرد
، 1.5 ملVWR20170-333
مجهر متعدد الفوتونات: Olympus MPE-RS TWINOlympusMPE-RS TWIN
الهدف: هدف الغمر المائي Ultra 25x MPE 1.05 NA ، 2 مم WDOlympusXLPLN25XWMP2
جيلي زيوت التشحيم الشخصية (جل)equateZH727 2E F1
SGM-4 جهاز التجسيمNarishige16030
SomnoSuite التخدير منخفض التدفق ليزر التحفيز SystemKent Scientific CorporationSS-01
: ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL الخاص بأوليمبوس ، قابل للضبط من 690 نانومتر إلى 1040 نانومتر ، عرض نبضة 100 fs في مستوىالعينة Spectra Physics
المركزي الدقيقة Spectra Physics

المراجع

  1. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  2. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
  3. Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
  4. Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
  5. Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
  6. Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179(2015).
  7. Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
  8. Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
  9. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  10. Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
  11. Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
  12. Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  13. Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
  14. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  18. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  19. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  20. Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
  21. Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
  22. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  23. Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
  24. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
  25. Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
  26. Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
  27. Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
  28. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  29. Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
  30. Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
  31. Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
  32. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  33. Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184(2015).
  34. Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

التصوير ثنائي الفوتونتنشيط الخلايا الليفيةالتفاعل بين TLR4 وLPSالفئران المراسلة جينياًFSP1cre tdTomatoارتباط LPS FITCالحقن داخل أخمص القدمالتصوير الحيتصوير الحيوانات الحيةإشارات البروتين الفلوري
في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.