Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm

Résumé

Nous rapportons l'électroporation d'ARN messager (ARNm) comme méthode qui permet l'expression rapide et efficace des protéines multiples dans le système de modèle d'embryon de caille. Cette méthode peut être utilisée pour étiqueter les cellules fluorescentes et enregistrer leurs mouvements in vivo par microscopie en accéléré peu de temps après l'électroporation.

Résumé

Nous rapportons que l'électroporation d'ARNm permet aux protéines fluorescentes d'étiqueter les cellules dans les embryons vivants de caille plus rapidement et plus largement que l'électroporation d'ADN. L'efficacité de transfection élevée permet à au moins 4 ARNm distincts d'être co-transfectés avec une efficacité de 87 %. La plupart des ARNm électroporated sont dégradés au cours des 2 premiers heures post-électroporation, ce qui permet d'effectuer des expériences sensibles au temps dans l'embryon en développement. Enfin, nous décrivons comment imager dynamiquement les embryons vivants électroporated avec des ARNM qui codent diverses protéines fluorescentes ciblées sous-cellulaires.

Introduction

L'électroporation est une méthode de transfection physique qui utilise une impulsion électrique pour créer des pores transitoires dans la membrane plasmatique, permettant à des substances comme les acides nucléiques ou les produits chimiques de passer dans le cytosol. L'électroporation est largement utilisée pour délivrer de l'ADN dans les bactéries, les levures, les plantes et les cellules de mammifères^1,2,3. Il est couramment utilisé pour introduire des charges utiles génétiques dans les cellules cibles et les tissus dans l'embryon aviaire en développement pour étudier le c....

Protocole

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives approuvées par l'Hôpital pour enfants de Los Angeles et les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie du Sud.

1. Vecteurs d'expression à base de pCS2 de génération

1. Pour cloner pCS2.Lifeact-eGFP, préparez l'épine dorsale vectorielle en digérant 2 g de pCS2.CycB1-GFP (une construction contenant un insert différent) avec BamHI (10 U) et BsrGI (10 U) dans un tampon de digestion approprié (voir Tableau des matériaux) dilué à 1x en réaction totale volume de 50 oL pour 1 h à 37 oC (voir

Résultats

l'électroporation d'ARNm est plus efficace que l'électroporation d'ADN

Nous avons utilisé pCS2. H2B-Citrine pour préparer l'ARNm transcrit in vitro. Étant donné que l'électroporation de l'ADN est habituellement effectuée à 1-2 g/L, nous avons utilisé une concentration équimolar d'ARNm (calculée pour être d'environ 0,25-0,5 g/L pour l'électroporation de l'ARNm). Nous avons d'abord testé l'efficacité de l'électrop.......

Discussion

Dans ce protocole, nous avons fourni des instructions étape par étape sur la façon de micro-injecter et d'électroporate précisément l'ARNm dans les cellules des embryons de caille gazateurs. Nous avons démontré que l'électroporation de l'ARNm synthétisée in vitro permet une expression rapide et efficace des protéines fluorescentes (F) dans les embryons de caille gazateurs (figure2 et 3). La fluorescence de la protéine H2B-citrine traduite par des ARNm électroporated s'est av.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique	Thermo Fisher
SP6 mMessage Machine kit de transcription in vitro	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phényl-polyéthylène glycol, t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol, Polyéthylène glycol tert-octylphénylphényléther
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2-(4-Amidinophényl)-6-chlorhydrate d’indolecarbamidine, 4&prime ;,6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole, dichlorhydrate DAPI
Whatman No.1 papier filtre	Sigma Aldrich	WHA1001125
glycérol	Sigma Aldrich	G9012
Urea	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi était un cadeau de Dorus Gadella (plasmide Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID :Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID : 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		Cet article
pCS.H2B-citrine	Addgene	53752	pCS-H2B-citrine était un cadeau de Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID :Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry était un cadeau de Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID :Addgene_53750)
Microscope inversé Zeiss LSM-780	Carl Zeiss Microscopy GmbH		Le LSM-780 est un microscope confocal et multiphotonique qui offre la sensibilité requise pour les travaux d’imagerie essentiels. Équipé d’une platine motorisée, d’un dispositif de mise au point automatique et d’un incubateur occultant sur le dessus de la scène, le 780 est un excellent microscope pour l’imagerie haut de gamme de cellules vivantes/embryonnaires. Le détecteur Quasar 32 canaux haute sensibilité permet l’imagerie spectrale, le démélange linéaire et l’acquisition d’images à grand nombre de couleurs (>4). L’excitation peut être réalisée avec des lasers à photons uniques à 6 lignes (405, 458, 488, 514, 564 et 633 nm), un laser à 2 photons Chameleon (cohérent) (plage de 690 nm à 1000 nm), et exécutée avec le logiciel système ZEN 2011 SP7 (Black).
Électroporateur in vivo CUY-21 EDIT	Bex Co., Ltd.
Électrode carrée plate en platine, longueur latérale 5 mm	Bex Co., Ltd.
Microscope stéréoscopique Olympus MVX10 FL	Olympus LifeScience
XM10 Olympus	LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) pour HCR (10 fois ; pH 7,4)			Pour préparer 1 L d’une solution mère 10 fois ;, mélanger 80 g de NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g de KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g de Na2HPO4 (anhydre ; Sigma-Aldrich S3264) et 2,7 g de KH2PO4 (anhydre ; Sigma-Aldrich P9791). Ajustez le pH à 7,4 avec du HCl et amenez le volume final à 1 L avec du H2O ultrapur. Évitez d’utiliser CaCl2 et MgCl2 dans le PBS pour la RCH. Il est important que le PBS pour le HCR soit préparé sous forme de solution sans RNase (par exemple, via un traitement au diéthylpyrocarbonate [DEPC]).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Ajouter 1 mL de Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) et 100 mL de 10× ; PBS à 890 mL de H2O distillé ultrapur. Filtrer la solution à travers un 0,2 &mu ; m filtrer et le stocker à 4 ? C jusqu’à l’utilisation.
1& fois ; solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (traitée au DEPC ; pH 7,4)
0,1 % Triton X-100

15593031LF701P5E Appareil photo monochrome