Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per un'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testis del topo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.

Abstract

La spermatogenesi definisce un processo altamente ordinato di differenziazione delle cellule germinate maschili nei mammiferi. In testis, la trascrizione e la traduzione sono disaccoppiate, sottolineando l'importanza della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica orchestrata dagli RPB. Per chiarire i ruoli meccanicistici di un RBP, la metodologia di immunoprecipitazione reticolazione (clip) può essere utilizzata per catturare i suoi bersagli endogeni diretti dell'RNA e definire i siti di interazione effettivi. Il CLIP migliorato (eCLIP) è un metodo appena sviluppato che offre diversi vantaggi rispetto alle clip convenzionali. Tuttavia, l'uso di eCLIP è stato finora limitato alle linee cellulari, chiedendo applicazioni espanse. Qui, abbiamo impiegato eCLIP per studiare MOV10 e MOV10L1, due helicasi di legame RNA noto, in testis del topo. Come previsto, troviamo che MOV10 si lega prevalentemente a 3' regioni non tradotte (UTR) di mRNA e MOV10L1 si lega selettivamente alle trascrizioni precursori di RNA (piRNA) che interagiscono con PIWI. Il nostro metodo eCLIP permette la determinazione rapida delle principali specie di RNA legate da vari RPB attraverso il sequenziamento su piccola scala di subcloni e quindi la disponibilità di biblioteche qualificate, come un mandato per procedere con sequenziamento profondo. Questo studio stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli per mammiferi.

Introduzione

Il testicolo dei mammiferi rappresenta un ottimo modello evolutivo in cui un intricato programma di differenziazione cellulare corre ciclicamente per produrre numerosi spermatozoi. Un valore unico di questo modello risiede nell'emergere dell'inattivazione trascrizionale in certe fasi della spermatogenesi, tipicamente quando l'inattivazione del cromosoma del sesso meiotico (MSCI) si verifica^1,2 e quando i spermatidi rotondi subiscono drastica compattazione nucleare durante lo spermiogenesi³. Questi eventi trascrizionali inconsecutivi richiedono una regolazione genica post-trascrizionale,....

Protocollo

Tutti gli esperimenti condotti sugli animali sono stati approvati dal comitato universitario di medicina di Nanjing. I topi maschi topi C57BL/6 sono stati mantenuti in condizioni di fotoperiodo controllato e sono stati forniti con cibo e acqua.

1. raccolta dei tessuti e crosslinking UV

1. Euthanize 2 topi adulti che utilizzano anidride carbonica (CO₂) per 1-2 min o fino a quando la respirazione si arresta. Successivamente, eseguire la dislocazione cervicale su ogni mouse.
2. Raccogli circa 100 mg di testicoli da topi di età appropriata (un testone adulto in questo studio) per ogni esperimento di immunoprecipitazione....

Risultati

La procedura eclip e i risultati sono illustrati nella figura 1, figura 2, Figura 3, figura 4. I topi sono stati eutanizzati con anidride carbonica e una piccola incisione è stata fatta nel basso addome utilizzando forbici chirurgiche (Figura 2a

Discussione

Con la crescente comprensione del ruolo universale degli RBPS in contesti sia biologici che patologici, i metodi di ritaglio sono stati ampiamente utilizzati per rivelare la funzione molecolare di RBPS^{20,32,33, 34,35}. Il protocollo qui descritto rappresenta un'applicazione adattata del metodo eCLIP ai testis del mouse.

Una sfida ne.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Antibodies
Anti-mouse MOV10  anticorpo	Proteintech, Cina	10370-1-AP
Anticorpo anti-MOV10L1 di topo	Zheng et al.20109	antisieri policlonali UP2175	forniti da P. Jeremy Wang lab, Università della Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Coniglio IgG	Beyotime, Cina	A7016
Attrezzatura
Centrifuga	Eppendorf, Amburgo, Germania	5242R
Sonificatore digitale	BRANSON, USA	BBV12081048A	450 Watt; 50/60 Hz
DynaMag-2 Magnete	Invitrogen, USA	12321D
Mini Modulo Blot	Invitrogen, USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen, USA	A25977
Incubatore a scuotimento	Eppendorf, Amburgo, Germania	Thermomixer comfort
Grinder per tessuti, Dounce	PYREX, USA	1234F35	solo... il pestello "sciolto" viene utilizzato in questo protocollo
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germania	numero di serie: 2604323
Revolver a tubo	Cristallo, USA	numero di serie: 3406051
reticolante	a luce UVP, USA	CL-1000<
strong>Materiali
TC-treated Culture Dish Corning	, USA	430167	100 mm
Provette	Corning, USA	430791	15 mL
Microprovette	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagenti
Fenolo acido/cloroformio/alcool isoamilico	Solarbio, Cina	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen, USA	NP0005
DH5α batteri competenti	Thermo Scientific, USA	18265017	queste celle economiche producono >1 x 106 trasformanti/µ g DNA di controllo per 50 µ L.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
Reagente ECL	Vazyme, Cina	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche, USA	04693132001	aggiungere fresco
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
Enzima FastAP	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarosio	lonza, Svizzera	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
Estrazione di gel MiniElute	QIAGEN, Germania	28604	magazzino di colonne a 4 ?; tampone QG=tampone di dissoluzione del gel; tampone PE= tampone di lavaggio (per il passaggio 14)
MyONE Perle di silano	Thermo Scientific, USA	37002D	Estrazione di acidi nucleici perle magnetiche
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%– Kit tampone NuPAGE MOPS SDS da 12%, 1,5 mm, 15 pozzetti
	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Tubo pesante in gel ad aggancio di fase (PLG)	TIANGEN, Cina	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
Proteinasi K	NEB, New England	P8107S
Miscela master PCR Q5	NEB, Nuova Inghilterra	M0492L
tampone RLT	QIAGEN, Germania	79216	tampone di lisi per purificazione dell'RNA
RNA pulito e Concentratore-5 colonne	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	Colonne di purificazione e concentrazione
dell'RNA RNasi I	Invitrogen, USA	AM2295
Inibitore della RNasi	Promega, USA	N251B
RQ1 DNasi	Promega,USA	M610A
Agente riducente del campione	Invitrogen,USA	NP0009
Soluzione SDS	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodio desossicolato	Sigma-Aldrich, USA	30970	proteggere da enzima
leggero T4 PNK	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligasi 1 alto conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, Cina	C601-01
TBE	Invitrogen, USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, Cina	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, Cina	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
Pellicole a raggi X	Caresteam, Canada	6535876