利用离体肠系膜动脉评估血管张力反应性：重点关注血管周围脂肪组织的调节作用

摘要

本方案描述了利用导丝肌动图技术评估从小鼠分离的肠系膜动脉的透壁等长张力的方法，特别关注内皮细胞和血管周围脂肪组织释放因子的调节作用。

摘要

血管张力对病理生理刺激的反应性改变，参与了多种心血管和代谢性疾病的发生发展。内皮功能障碍是导致动脉舒张功能减弱和收缩反应增强的主要原因。包绕在动脉周围的脂肪组织在调控血管内皮依赖性舒张和/或血管平滑肌细胞收缩中发挥重要作用。内皮细胞与血管周围脂肪组织之间的相互作用，可通过离体血管环张力测定系统（wire myography）对固定后的血管进行评估。然而，对于来自不同物种、年龄、遗传背景和/或处于不同病理生理状态动物的动脉，需建立相应的最佳实验条件。

引言

动脉的扩张和收缩分别由其血管平滑肌细胞的舒张和收缩实现。小动脉血管反应性的改变通过自主神经和血液中存在的激素（如儿茶酚胺、血管紧张素II、5-羟色胺、血管加压素）参与动脉血压的稳态调节。在局部水平，平滑肌细胞的血管反应受到来自内膜内皮细胞以及动脉周围脂肪组织信号的调节（图1）。

内皮不仅是一种被动屏障，还作为血液与深层血管平滑肌细胞之间传递信号的界面。通过释放多种血管活性物质，内皮在局部调控血管张力反应中发挥关键作用¹。例如，当受到乙酰胆碱刺激时，内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）被激活，产生一氧化氮（NO），NO通过激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）引起深层血管平滑肌的舒张²。其他血管活性物质包括环氧化酶的产物（如前列环素和血栓素A₂）、脂氧合酶的产物（如12-羟基二十碳四烯酸，12-HETE）、细胞色素P450单加氧酶的产物（HETEs和环氧二十碳三烯酸，EETs）、活性氧（ROS）、血管活性肽（如内皮素-1和血管紧张素II）以及内皮源性超极化因子（EDHF）³。内皮源性血管舒张因子与血管收缩因子之间的精细平衡维持着局部血管运动张力^4,5<....

方案

本研究使用的所有动物均由香港大学医学院实验动物部提供。实验已获得实验室动物使用教学与研究委员会（CULATR，编号：4085-16）的伦理批准。

1. 准备工作

1. 药物的制备
   1. 根据材料安全数据表（MSDS）的要求，在收到药物后立即进行适当储存。将粉末状药物溶解于溶剂中，配制成高浓度储备液，分装后于 -20 °C 保存。
      注意：大多数药物使用蒸馏水溶解以配制储备液；某些药物可能需要加热或超声处理才能完全溶解。若药物在水中无法完全溶解，可加入一滴1 M NaOH溶液；对于碱性药物，可加入一滴1 M HCl溶液。疏水性药物可用二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇溶解。在后两种情况下，应明确最终浴液中的溶剂浓度（单位为M），并设置相应的对照实验，以排除溶剂对实验结果的影响。
   2. 实验前，将药物等分试样溶解（材料表)置于含有 115 mM NaCl、4.6 mM KCl、2.5 mM CaCl₂ 的克雷布斯-林格碳酸氢盐溶液（Krebs）中₂，1.17 mM MgSO₄₄，1.17 mM KH₂PO₄，25 mM NaHCO₃_3, 11.1 mM D-葡萄糖和 0.01 mM EDTA，pH 7.4。
   3. 对于累积浓度....

结果

通过测定长度/张力关系以获得归一化因子k

施加于血管段的牵张程度会影响肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的程度，从而影响所产生的最大主动收缩力。因此，对于每种类型的血管，必须确定产生最大主动收缩力所需的牵张程度，以确保血管肌张力实验的准确性。本文对从小鼠模型中分离的肠系膜动脉进行了长度/张力关系的标准化处理（图2）。将动脉段悬挂在四腔丝状肌张仪系统（见材料表）的不锈钢针（直径40 μm）上。通过连接至装有记录程序计算机的模数转换器记录等长张力。每个腔室含有5 mL Krebs缓冲液，维持在37 °C，并以95% O₂ 和5% CO₂ 持续通气，以在整个实验过程中将pH值维持在7.4。通过逐步牵张动脉段建立被动的长度/张力关系，直至达到相当于100 mmHg跨壁压的内周长（I.......

讨论

除了内皮细胞外，源自血管周围脂肪组织（PVAT）的信号在调控平滑肌张力反应性方面也发挥着重要作用³⁰。健康的PVAT会释放一氧化氮（NO）和具有抗炎作用的脂联素，对动脉产生抗收缩效应；但在肥胖和代谢综合征等病理状态下，这种效应会丧失^31,32。在疾病状态下，PVAT可促进内皮功能障碍及其他心血管异常的发生发展^33,34。已有研究报道，在肥胖动物的动脉PVAT中，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达和功能均出现异常^35,36。由于内皮功能障碍和PVAT功能障碍均参与心血管及代谢异常的发生发展^23,37，因此在进行离体血管实验时，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰胆碱	Sigma-Aldrich	A6625	储备浓度: 10-1 M 工作浓度: 10-10 至 10-5 M
L-NAME（Nω-硝基-L-精氨酸甲酯）	Sigma-Aldrich	N5751	储备浓度: 3 × 10-2 M 工作浓度: 10-4 M
去氧肾上腺素	Sigma-Aldrich	P6126	储备浓度: 10-2 M 工作浓度: 10-10 至 10-5 M
U46619（9,11-二脱氧-9α,11α亚甲基环氧前列腺素 F2α）	Enzo	BML-PG023-0001	储备浓度: 10-5 M 工作浓度: 1-3 × 10-8 M
多丝肌动描记仪	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 野生型小鼠	中国香港大学实验动物部	CULATR 编号：4085-16
硅涂层培养皿	Danish MyoTechnology (DMT)
钨丝	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
手术器械