本文介绍了几种用于评估三维肿瘤细胞球体存活与死亡的简单方法。相比二维培养，三维细胞球体能更真实地模拟体内肿瘤的理化梯度环境。因此，该球体模型可更准确地评估抗癌药物的疗效，并提高向体内条件的转化预测能力。
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摘要
摘要
癌细胞的三维球状体是癌症药物筛选和深入理解癌细胞生物学机制的重要工具。该模型的优势在于能够模拟肿瘤体内环境的多个方面，同时具备快速、经济和多功能的特点，适合进行相对高通量的筛选。球状体培养条件可重现肿瘤内部的理化梯度，包括从球状体外围向核心方向细胞外酸性逐渐增强、乳酸水平升高，以及葡萄糖和氧气供应逐渐减少。此外，该模型在一定程度上也模拟了体内肿瘤的机械特性和细胞间相互作用。不同类型的癌细胞所形成的三维球状体在具体特性上存在显著差异，因此其最佳生长条件也各不相同。此外，对三维球状体中细胞活力和死亡的评估方法，在部分方面需区别于二维培养所采用的方法。本文中，我们描述了多种制备癌细胞三维球状体的实验方案，以及利用此类培养体系在评估抗癌药物疗效背景下检测细胞活力与死亡的方法。
引言
多细胞球状模型在癌症生物学中的应用已有数十年历史1,2，但近年来获得了显著发展。这在很大程度上反映了人们日益认识到癌细胞表型对其微环境和特定生长条件的高度依赖性。实体瘤中的微环境与相应正常组织中的微环境存在根本性差异，包括pH值、氧张力以及间质压力等理化条件，还有营养物质、代谢废物和分泌的信号分子（如生长因子、细胞因子）等可溶性因子的浓度梯度。此外，还包括细胞外基质（ECM）的结构、细胞间相互作用和细胞间信号传导，以及肿瘤特有的三维（3D）结构的其他方面3,4,5,6。癌细胞所处的特定微环境条件深刻影响其基因表达谱和功能特性，显然，与二维（2D）培养的细胞相比，3D球状体的表型更接近体内肿瘤的真实状态7,8,9,10,11。即使2D模型通过低氧、酸性pH和高乳酸浓度来模拟已知的肿瘤微环境特征，仍无法再现肿瘤内部产生的理化参数梯度及其三维结构。另一方面，动物模型成本高、耗时长，存在伦理问题，且通常在模拟人类肿瘤条件方面也存在局限性。因此，3D球状体已被广泛应用于大多数实体瘤多种特性的研究中，作为复杂程度介于2D培养与动物模型之间的中间模型9,11,12,13,14,15,16,17。
三维类球体被广泛应用于抗癌治疗效果的筛选实验9,18,19,20。治疗反应对肿瘤微环境高度敏感，这既体现在药物递送过程中受到迂曲结构、扩散受限、高间质压以及酸性环境pH的影响，也体现在缺氧及其他微环境因素对细胞死亡反应的作用9,17。由于三维类球体内部天然会形成上述所有特性7,8,9,10,11，采用三维细胞培养可显著提高实验结果向体内条件的转化能力，同时仍能实现高效且经济的大规模净生长筛选。然而，目前绝大多数关于癌细胞药物反应的研究仍是在二维条件下进行的。这可能是因为，尽管某些检测方法可相对容易地应用于三维细胞培养，但许多其他方法（如细胞活力检测、Western印迹和免疫荧光分析）在二维条件下操作远比在三维条件下便捷。
本研究的目的是在模拟三维肿瘤的环境中，提供易于操作的检测方法和精确的实验方案，用于分析抗癌药物处理对癌细胞活力和存活率的影响。具体而言，我们提供并比较了三种不同的类球体形成方法，随后介绍了对生长、活力及药物反应进行定性和定量分析的方法。
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方案
1. 类球体的生成
- 制备用于球体形成的细胞悬液
注意： 不同的细胞系具有显著差异的黏附特性，因此必须针对每种细胞系建立最合适的类球体形成方案。我们发现 MCF-7 和 BxPC-3 细胞适用于自发形成球体，而 MDA-MB-231、SKBr-3、Panc-1 和 MiaPaCa 细胞则需要添加重建基底膜才能成功形成球体。目前仅 MDA-MB-231 和 BxPC-3 细胞被用于悬滴法实验，但其他细胞系也完全适用。- 以单层培养细胞，直至细胞融合度达到70-80%。
- 用磷酸盐缓冲液（1x PBS，25 cm² 培养瓶加 5 mL）洗涤细胞2 或 10 mL 用于 75 cm2 烧瓶）中加入细胞解离酶（25 cm²培养瓶加入0.5 mL）2 或 1 mL 用于 75 cm² 培养瓶2 烧瓶）并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 2–5 分钟2 和95%湿度。
- 在显微镜下观察细胞脱落情况，并通过加入含6-10%血清（根据细胞系确定）的完全培养基至总体积5 mL，以中和细胞解离酶活性。2 或 10 mL 用于 75 cm² 培养瓶2 烧瓶
- 使用布氏计数板对细胞进行计数，每份细胞样本计数计数板中的8个方格，以获得高度可重复的类球体大小。
注意： 以下是三种分别描述不同类球体形成方法的实验方案。方案1.2和1.3可用于后续所有分析实验方案，而方案1.4最适合用于包埋和裂解液制备。根据细胞系的不同，无论采用何种方法，类球体形成均需2至4天。
- 自发球状体形成
- 执行步骤 1.1.1–1.1.4。
- 将细胞悬液在15 mL离心管中稀释，以获得0.5–2 × 10⁶个细胞/mL4 细胞/mL（每种细胞系的最佳细胞密度需另行确定）(图1A（ii）).
- 在周围一圈的孔中加入1× PBS或培养基，以减少其余各孔中液体的蒸发。 将细胞悬液转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器向超低吸附96孔圆底板每孔加入200 µL（图1A (iii)).
- 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2，95% 湿度。
- 每2-3天对类球体进行一次光学显微镜成像。
注意： 本文中的图像采用11.5倍放大倍数拍摄，适用于使用这些方案制备的大多数类球体。 - 每2-3天（在获取图像后）更换100 µL培养基（移除100 µL用过的培养基，并加入100 µL新鲜培养基）。
注意： 为避免在更换培养基时移除类球体，建议在缓慢吸取培养基时略微倾斜培养板，并在丢弃前检查吸头中的废液是否含有可见的类球体。
- 重建基底膜介导的球状体形成
注意： 无乳酸脱氢酶升高病毒（LDEV）的低生长因子重组基底膜（rBM）被使用。rBM 具有温度敏感性，必须始终置于冰上保存，因其在达到 15 °C 时会发生凝结。在包被前，将 rBM 置于冰上解冻，可于 4 °C 过夜或室温下 2–4 小时完成解冻。- 在冰上解冻rBM（参见 材料表).
- 使用前将培养板和储液槽（若单独包装）置于冰上。
- 执行步骤 1.1.1–1.1.4。
- 在外部一圈的孔中加入1×PBS或培养基，以减少其余各孔中液体的蒸发。将细胞悬液在15 mL离心管中稀释，以获得0.5–2 × 104 细胞/mL（每种细胞系的最佳细胞密度需自行确定）(图1A (ii)).
- 将含有稀释细胞悬液的15 mL离心管置于冰上（例如，放入玻璃烧杯中）（图1A (iia)).
- 将预冷的培养板和储液槽转移至生物安全柜中。冲洗塑料容器，装满冰后放入生物安全柜内，以便在整项操作过程中将培养板和储液槽置于冰上。
- 轻轻重悬rBM，以确保形成均匀的凝胶。
- 向预冷的细胞悬液中加入1-2% rBM（最佳浓度需根据每种细胞系确定）（图1A (iib)).
- 将15 mL离心管倒置，以确保rBM与细胞悬液充分混匀，然后再将悬液加入培养板中。
- 将含有rBM的细胞悬液转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器将200 µL/孔的细胞悬液分装至预冷的超低吸附96孔板中（图1A (iii)).
注意： 若同时处理多个细胞悬液（例如，超过一种细胞系），在加入rBM后应立即分装每种细胞悬液，以防止过早凝胶化。 - 将培养板在750 × g条件下离心15分钟 g 使用“慢速减速”模式或不刹车（如有可能，可在4 °C条件下离心以延长rBM液体状态的时间，但此步骤并非成功形成球体所必需），以确保在rBM凝固时细胞聚集在一起，从而促进单个球体的形成。
- 在培养箱中孵育平板（37 °C，5% CO₂）2，95% 湿度）。
- 每2-3天采集一次光学显微镜图像，以评估球状体的生长情况。
- 每2-3天更换100 µL培养基（移除100 µL原有培养基，并加入100 µL新鲜培养基）。
- 悬滴法球状体
- 执行步骤 1.1.1–1.1.4。
- 将细胞稀释至合适的浓度，实用的稀释浓度为 50,000 个细胞/mL。
- 取下10 cm培养皿的皿盖2 细胞培养皿并将其开口向上放置。向培养皿中加入6 mL 1×PBS图1B (i)).
- 将细胞悬液倒入无菌储液槽中，使用多通道移液器小心地将最多30滴、每滴40 µL的细胞悬液滴加到细胞培养皿的盖子上图1B (ii)），使每滴细胞浓度为2,000个细胞/滴。避免将液滴点在盖子边缘附近，因为在下一步翻转盖子时，靠近边缘的液滴更容易失去表面张力。
- 快速但受控地翻转盖子，并将其放置在含有1x PBS的细胞培养皿上图1B (iii)).
- 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 并在不扰动液滴的情况下，于95%湿度环境中培养4-6天。
- 若用于蛋白裂解液制备或包埋，可打开盖子后倾斜培养板，加入1 mL预热培养基冲洗液滴，以收集类球体。转移所得培养基 将含有类球体的溶液转移至1.5 mL离心管中，静置使其沉降至管底。随后分别按照4.4和6.2.2步骤进行蛋白裂解和包埋处理。
2. 类球体的药物处理
注意：可对类球体进行长期药物处理，以筛选目标药物的作用效果。在开始药物处理之前，建议先对该药物（或多种药物）进行剂量-反应实验，以确定实验处理所需的合适剂量。药物剂量应基于已确定的药物IC50/Ki值，并在此值的约0.2倍至10倍范围内设置梯度。
- 根据1.2或1.3节所述方法，为每种实验条件设置6-12个类球体，并置于培养箱中（37 °C，5% CO2，95%湿度）培养2天。
- 第2天，对类球体进行明场显微成像。
- 获取图像后，配制第一轮处理用药物剂量。
注意：由于药物溶液加入含有100 µL培养基的孔中时会以1:2比例稀释，因此第一轮加药浓度应为所需终浓度的两倍。建议的给药时间点（需根据药物半衰期调整）：第2、4、7天。 - 使用多通道移液器轻轻吸除100 µL培养基，并替换为100 µL含药物的新鲜培养基。
- 将96孔板重新放回37 °C、5% CO2、95%湿度的培养箱中，并在预定的后续处理时间点重复步骤2.3和2.4，但此后不再加倍药物浓度，以确保达到正确的终浓度。
- 在实验方案或处理周期的最后一天，可选择进行以下一种或多种检测分析。
3. 类球体细胞活力检测
- 按照1.2或1.3节所述方法，每种实验条件设置4-6个类球体，并置于37 °C、5% CO2和95%湿度的培养箱中培养。
注意：本实验中，在培养第7天或第9天进行细胞活力检测，此前已按照上述方法（第1.2.5和1.3.13节）每隔2-3天通过光学显微镜监测类球体的生长情况。 - 解冻细胞活力检测试剂（见材料表），并在使用前使其平衡至室温。
- 轻轻颠倒混匀，以获得均一的溶液。
- 在进行检测前，从类球体培养孔中移除50%的培养基（100 µL）。
- 按试剂与孔中培养基体积1:3的比例，向每个孔中加入细胞活力检测试剂（图2A (i)）。对于96孔板，向100 µL培养基中加入50 µL试剂。
- 剧烈振荡混匀5分钟，以诱导细胞裂解（图2A (ii)）。
- 在室温下孵育25分钟，以稳定发光信号（图2A (iii)）。
- 记录发光信号（图2A (iv)）。
4. 从三维球状体培养物中制备用于蛋白质印迹的蛋白裂解液
注意： 收集球状体时，建议使用P200移液器，并剪切吸头末端以增大开口，从而更轻松地捕获球状体，同时避免破坏其结构。
- 针对每个条件，将至少12个、理想情况下18–24个类球体（根据类球体大小而定）收集至1.5 mL离心管中（避免使用2 mL离心管，因其底部较不尖锐，后续操作将更加困难）。
注意： 如果在收集完所有类球体之前培养基体积已超过1.5 mL，请让已收集的类球体自然沉降至管底（沉降非常迅速，无需离心），弃去管内一半体积的液体，再继续收集剩余的类球体。 - 将离心管置于冰上，使类球体沉降至1.5 mL管底部。
- 从无菌细胞实验室转移至普通实验室。
- 用1 mL预冷的1× PBS洗涤类球体两次。每次洗涤后，在去除1× PBS前让类球体充分沉降。
- 尽可能吸除1× PBS，注意不要扰动或吸走类球体。
- 每1个类球体加入5 µL含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的预热裂解缓冲液（LB）（例如，10个类球体 = 50 µL LB）。
- 重复涡旋与离心操作，直至类球体完全溶解。每个循环包括30秒涡旋，随后进行10秒短暂离心（使用台式离心机快速离心即可），根据类球体的大小和致密程度，重复约5–10分钟。
注意： 此处可暂停实验流程。将裂解物保存于-20 °C，待后续进行超声处理、匀浆及蛋白定量，操作参照标准的二维（2D）蛋白裂解物实验流程，之后按标准方案进行Western blot检测。
5. 类球体的碘化丙啶（PI）染色
- 按照1.2或1.3节所述，为每个实验条件设置3-6个球状体，并将其置于37 °C、5% CO2和95%湿度的培养箱中。
- 在无菌细胞培养实验室中，将1×PBS加热至37 °C。
- 通过将储备液用1×PBS稀释，配制4 µM的碘化丙啶（PI）溶液：将1 mg/mL的PI水溶液在1×PBS中按1:350比例稀释。
注意：该溶液加入孔板后浓度将被进一步稀释一倍，最终浓度为2 µM。每个含有球状体的孔需要100 µL该溶液。
注意：碘化丙啶（PI）必须在通风橱内操作，并佩戴手套。PI对光敏感，操作时应避光。 - 从96孔板的每个孔中移除100 µL培养基，注意不要移走球状体。
- 向所有孔中加入100 µL预热的1×PBS以洗去残留培养基，随后吸除孔中的100 µL液体。重复此洗涤步骤3次。
- 向每个孔中加入100 µL PI溶液，用铝箔包裹孔板，并将其置于37 °C、5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育10-15分钟。
- 重复步骤4.5中所述的3次洗涤步骤，以去除PI溶液，从而在成像时降低背景信号。
- 使用落射荧光显微镜对球状体进行成像。为评估球状体核心区域细胞的存活情况，应采集z轴层扫图像，以获得球状体不同深度的图像。
注意：建议根据球状体大小，每层之间的步进尺寸约为18-35 µm，每个球状体大约获得11-18层图像。可使用ImageJ中的z轴投影功能（z-projection）对z轴层扫图像进行处理，将所有层图像合并为一张最终图像，从而全面展示球状体内部的染色情况（有关ImageJ在此用途中的进一步操作指南，请参见https://imagej.net/Z-functions）。
6. 三维球状体的包埋
- 制备用于包埋类球体的琼脂糖凝胶（仅首次执行本方案时需要）。
- 将1 g细菌琼脂与50 mL去离子水（ddH2O）混合。
- 在微波炉中缓慢加热，直至细菌琼脂完全溶解并形成均匀的凝胶。切勿使凝胶沸腾。
- 将细菌琼脂在60 °C水浴中保温。
- 实验间期保存于4 °C。
- 类球体的包埋。
- 第1天，针对每种实验条件，将至少12个类球体收集至一个1.5 mL离心管中。
- 用1 mL冰上预冷的1×PBS洗涤一次。
- 加入1 mL 4%多聚甲醛以固定类球体。
注意：多聚甲醛的操作应在通风橱中进行。 - 室温下孵育24小时。
- 第2天，将琼脂糖凝胶小心加热：将其置于盛有水的烧杯中，并放入微波炉加热。确保凝胶不沸腾！加热后置于60 °C的台式加热板上保温，直至使用。
- 用1 mL冰上预冷的1×PBS将类球体洗涤两次。
- 吸除大部分1×PBS（保留约100 µL，便于后续操作类球体）。
- 准备一支20 µL移液枪，将枪头斜向剪开，以获得更尖且孔径更大的枪头（见示意图）。
注意：下一步操作需迅速完成，以确保类球体高效转移并防止凝胶液滴凝固。若无加热金属块，建议先捕获类球体，再制备琼脂糖液滴（即调换步骤6.2.9与6.2.10的顺序）。 - 在载玻片上滴加一滴琼脂糖凝胶，并将载玻片置于温热的加热金属块上，防止琼脂糖凝固。
- 使用经改造的移液枪头（见步骤6.2.8），在15–20 µL体积内尽可能多地捕获类球体。
- 小心地将含有类球体的15–20 µL 1×PBS注入琼脂糖凝胶液滴中心，避免枪头接触载玻片。
注意：此步骤略有难度。若移液枪头在注入过程中接触载玻片，类球体可能丢失。建议先用有色液体注入凝胶液滴，练习整个制备凝胶滴和注入类球体的过程。这样可直观观察是否穿透液滴，因有色液体会渗出至载玻片表面。 - 在室温或4 °C孵育5–10分钟，使琼脂糖凝胶液滴硬化。当凝胶液滴已部分凝固（但仍较柔软）时，用手术刀小心地将凝胶块从载玻片推入塑料组织包埋盒中。
- 用70%乙醇覆盖塑料组织包埋盒。
注意：此时类球体可直接使用，也可长期保存数月。 - 将包埋在琼脂糖中的类球体进行石蜡包埋，切片为2–3 µm厚的切片，随后进行苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色。
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结果
基于图 1A 和 1B 所示球状体形成方案的球状体生长实验，被用作在三维肿瘤模拟环境中分析抗癌药物处理效果的起始分析方法。球状体形成的难易程度具有细胞系特异性，某些细胞系需要添加rBM才能形成结构完整的球状体22。添加的rBM浓度会显著影响球状体的形态。如图 1C 和 1D 所示，在0%至4%范围内改变rBM浓度，会以细胞类型依赖的方式影响球状体的致密程度和形态。图 1C 显示，添加不超过2.5%的rBM可促进SKBr-3乳腺癌细胞形成球状体，而rBM浓度高于2.5%时则无进一步影响。相比之下，具有上皮样形态的BxPC3胰腺导管...
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讨论
三维癌细胞球状体的使用已被证明不仅在抗癌药物筛选方面具有重要价值和广泛适用性，而且有助于深入理解在模拟肿瘤微环境条件下癌细胞死亡与存活的调控机制。这一点尤为关键，因为化疗药物的可及性、细胞摄取以及细胞内效应会受到肿瘤内部理化条件的显著影响，这些条件包括pH值、氧张力、结构曲折性以及细胞间的物理和化学相互作用9,17。例如，许多实体瘤中细胞外pH值可低至6–6.525,26,27,28,29，这种酸性环境会使弱碱性化疗药物（如阿霉素、米托蒽醌以及两性离子紫杉醇）发生质子化而带电，从而降低其进入肿瘤细胞的效率，并可能影响诸如P-糖蛋白等多重耐药蛋白的活性30
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Katrine Franklin Mark和Annette Bartels提供的出色技术协助，感谢Asbjørn Nøhr-Nielsen完成了图1D中的实验。本研究由Einar Willumsen基金会、诺和诺德基金会（Novo Nordisk Foundation）以及Fondation Juchum基金会资助（均授予SFP）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-脒 (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | 用于细胞核染色 |
| 5-氟尿嘧啶 (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | 化疗治疗组分 |
| 5-(N-乙基-异丙基)阿米洛利 (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | NHE1 抑制剂 |
| PARP 和 cPARP 抗体 | Cell signaling | #9542 | 用于 Western 印迹 |
| Ki-67 抗体 | Cell signaling | #9449 | 用于免疫组化 (IHC) |
| p53 抗体 | Cell Signaling | #2524 | 用于免疫组化 (IHC) |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5441 | 用于 Western 印迹 |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | 用于琼脂糖凝胶制备 |
| Benchmark 蛋白质分子量标准 | Invitrogen | #10747-012 | 用于 SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC 蛋白质测定试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | 用于裂解液中的蛋白质定量 |
| Bürker 计数板 | Marienfeld | 610311 | 用于细胞计数 |
| BX63 正置荧光显微镜 | Olympus | 用于荧光成像 | |
| CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒 | Promega | #G9681 | 用于细胞活力检测 |
| 顺铂 | Sigma-Aldrich | #P4394 | 化疗治疗组分 |
| Corning 类球体微孔板，96 孔，黑色带透明圆底， 超低吸附，带盖，无菌 | Corning | #4520 | 用于培养类球体并以发光检测为终点 |
| Corning 96 孔，透明圆底， 超低吸附微孔板，带盖，无菌 | Corning | #7007 | 适用于无需以发光检测为终点的类球体培养 |
| Criterion TGX 预制胶 | Bio-Rad | 5671025 | 用于 SDS-PAGE |
| 多柔比星 | Abcam | #120629 | 化疗治疗组分 |
| FLUOStar Optima 微孔板读数仪 | BMG Labtech | 用于记录发光信号 | |
| 甲醛 | VWR Chemicals | #9713.1000 | 用于细胞固定 |
| Geltrex LDEV-无、生长因子减少型基底膜基质 | Gibco | #A1413202 | 需保存于 4 °C 以防止凝固。在方案中简称为 rBM。 |
| 热灭活胎牛血清 (FBS) | Sigma | #F9665 | 生长培养基中的血清组分 |
| ImageJ | NIH | 科学图像分析软件 | |
| Medim Uni-safe 包埋盒 | Medim Histotechnologie | 10-0114 | 用于储存包埋的类球体 |
| Mini 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | 用于裂解缓冲液制备 |
| MZ16 显微镜 | Leica | 用于明场显微图像采集 | |
| NuPAGE LDS 4x 上样缓冲液 | Invitrogen | #NP0007 | 用于 Western 印迹 |
| Pierce ECL Western 印迹底物 | Thermo scientific | #32106 | 用于 Western 印迹 |
| 丽春红 S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | 用于蛋白质条带染色 |
| Prism 6.0 | Graphpad | 科学绘图与统计分析软件 | |
| 碘化丙啶 (1 mg/ml 水溶液) | Invitrogen | P3566 | 避光保存 |
| 无菌多通道储液槽 | SPL lifesciences | 21002 | 用于接种细胞以形成类球体 |
| Superfrost Ultra-Plus 黏附载玻片 | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | 用于包埋的显微镜载玻片 |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | #T5648 | 用作化疗治疗 |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | #170-4159 | 用于 Western 印迹 |
| Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液 | Bio-Rad | #161 0732 | 用于 SDS-PAGE |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma | #T4174 | 细胞解离酶 |
参考文献
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