המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרואורגניזמים מעיים אנושיים הפכו לאחרונה למטרה חשובה של מחקר בקידום בריאות האדם ומניעת מחלות. כתוצאה מכך, חקירות של אינטראקציות בין אנביוקינטיקה (למשל, תרופות וטרום ביודונטיה) ומיקרוביוטה לבטן הפכו לנושא מחקר חשוב. עם זאת, בניסויים vivo עם מתנדבים אנושיים אינם אידיאליים למחקרים כאלה בשל ביואתיקה ואילוצים כלכליים. כתוצאה מכך, מודלים בעלי חיים שימשו להערכת האינטראקציות הללו בvivo. למרות זאת, לימודי מודל בעלי חיים עדיין מוגבלים בשיקולים ביולוגיים, בנוסף לקומפוזיציות והבדלים שונים של מיקרוביוטה בבעלי חיים לעומת בני אדם. אסטרטגיית מחקר אלטרנטיבית היא השימוש בניסויים תסיסה אצווה המאפשרים הערכה של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בטן במבחנה. כדי להעריך את האסטרטגיה הזאת, נעשה שימוש ב-EP (ביף) האקפוליסכאנטיות (בדומה) כנציג מסוג xenobiotic יוטי. לאחר מכן, האינטראקציות בין ביף EPS לבין מיקרוביוטה בבטן האדם נחקרו באמצעות מספר שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ניתוח מקומי קהילתי חיידקי עם רצף התפוקה הגבוה של 16 rRNA, וכרומטוגרפיה של גז של חומצות שומן קצרות (SCFAs). המוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת. וחשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם שונה כדי לחקור אינטראקציות כלליות בין האנדוביוטיקה אחרים המעיים microbiota.
מבוא
מיקרוביוטה במעיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המעי האנושי ובבריאות המארחת. כתוצאה מכך, המעיים microbiota לאחרונה להיות יעד חשוב למניעת מחלות וטיפול1. יתר על כן, בקטריה המעיים אינטראקציה עם תאי מעיים מארחים ומווסת תהליכים מארחים יסודיים, כולל פעילויות מטבוליות, זמינות מזינים, אפנון מערכת חיסונית, ואפילו תפקוד המוח וקבלת ההחלטות2,3 . אנדוביוטיקה יש פוטנציאל רב להשפיע על הרכב חיידקי וגיוון של מיקרוביוטה בטן. כך, אינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם משכו את תשומת הלב מחקר הגוברת4,5,6,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של הונאן אוניברסיטת המדע והנדסה (הונאן, סין), ואת אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג גונגאנג (ג'ג'יאנג, סין).
1. הכנת חיידקים
- הכנת מרק בינוני ביפידוחיידק
- שלב את הרכיבים הבאים ב 950 מ ל של מים מזוקקים: תמצית בשר, 5 g/L; תמצית שמרים, 5 גר'/L; פנימה של קזאין, 10 גרם/ליטר; soytone, 5 g/L; גלוקוז, 10 g/L; K2hpo4, 2.04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.22 g/L; . בסדר. H20, 0.05 g/L; המשך, 5 גר'/L; . רצף 80, 1 מ ל תמיסת מלח, 40 mL (CaCl2.2 h2O, 0.25 g/L; KH2פו4, 1 g/L; נחקו3, 10 גר'/L; הרוג, 2 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הייצור של EPS mucoid ניתן לצפות ב -B. longum התרבויות על לוחיות pyg לאחר דגירה אנאירובית עבור 72 h (איור 1a). צנטריפוגה של שריטות התרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא את האוסף של תאית כמו EPS (איור 1B). EPS מיובש ועמילן מסיסים שימשו לאחר מכן כמקורות פחמן לתרבויות תסיסה. השימוש ב-oligosaccharide לצורך הפרדה וניתוח טוהר בשל העלות הנמוכה והתוצאות המהירות18. למרות שקצב ההתדרדרות של העמילן על ידי מיקרוביוטה של הצואה האנושית היה מה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התקדמות משמעותית נעשתה לקראת הבנה מיקרוביוטה הבטן האנושית הרכב ופעילויות בעשור האחרון. כתוצאה ממחקרים אלה, הושג הולובימונט, המייצג את האינטראקציות בין מחשבים מארחים לבין קהילות מיקרוביאלית הקשורות, כגון בין בני אדם לבין המעיים שלהם מיקרוביוטה19,20. יתר על כן, בני האדם נחשבים כעת גם כיום בתור סופר אורגניזמים21, שבו מיקרוביוטה בטן הוכרה כאחד האיברים הפונקציונליים בבני אדם22,23. הגוף .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. הנתונים הצוטטים ביין ואח '. . בסדר, 11
תודות
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31741109), קרן הונאן למדעי הטבע (No. 2018JJ3200), ואת התוכנית לבנות של משמעת אופיינית מיושם באוניברסיטת הונאן של המדע וההנדסה. אנו מודים LetPub (www.letpub.com) על הסיוע הלשוני שלה במהלך הכנת כתב היד הזה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.22 ומיקרו; מסנני ממברנה m | Millipore SLGP033RB | השתמש לסינון דגימות | |
| 0.4 מ"מ מסננת | תרמו פישר | 308080-99-1 | השתמש להכנת דגימות צואה אנושיות |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | השתמש להכנת צלחת צבע |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | מדגם סטנדרטי עבור SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | הרכיב של |
| תא אנאירובי | Electrotek | AW 400SG | תרבית חיידקים ותסיסה |
| חיטוי | SANYO | MLS-3750 | השתמש לחיטוי |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | הרכיב של |
| תנור אפייה | שנחאי Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | השתמש לחימום ואפייה |
| של תמצית בקר | Solarbio | G8270 | הרכיב של בינוני |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | חיידקים |
| מלחי מרה | Solarbio | YZ-1071304 | הרכיב של מדגם |
| בוטירי | בינוני Sigma-Aldrich | 19215 | עבור SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | תמיסת מלח של |
| עמוד נימי | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 מ"מ ופעמים; 30 מ' ופעמים; 0.25 μ m) | משמש לזיהוי SCFA |
| קזאין פפטון | סיגמא-אולדריץ' | 39396 | הרכיב של |
| צנטריפוגה | בינונית Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | שימוש לצנטריפוגה |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | הרכיב של |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | הרכיב של בינוני |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | הרכיב של |
| אתנול | Sigma-Aldrich | E7023 | השתמש להכנת ויטמין K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | הרכיב של |
| חומצה פורמית | Sigma-Aldrich | 399388 | משמש |
| לכרומטוגרפיה של גז | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | משמש לזיהוי SCFA |
| זכוכית | פישר סיינטיפיק | FB10050 | משמש להכנת תרחיץ |
| גלוקוז | Solarbio | G8760 | הרכיב של |
| בינוני Haemin | Solarbio | H8130 | הרכיב של |
| HCl | בינוניSigma-Aldrich | 30721 | תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים |
| איזובוטירית | Sigma-Aldrich | 46935-U | מדגם סטנדרטי עבור |
| חומצות איזווולריות | Sigma-Aldrich | 129542 | מדגם סטנדרטי עבור SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | תמיסת מלח של |
| KCl | Solarbio | P9921 | הרכיב של בינוני |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | תמיסת מלח של |
| LiCl.3H2O | בינוני Solarbio | C8380 | השתמש להכנת צלחת צבע |
| תמצית בשר | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | הרכיב של |
| חומצה מטפוספורית | Sigma-Aldrich | B7350 | דגימה סטנדרטית עבור SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | הרכיב של |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | תמיסת מלח של מערכת |
| MISEQ | בינונית | Illumina MiSeq 300PE | רצף DNA |
| MnSO4. H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | תמיסת מלח של |
| בינוני Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | אנטיביוטיקה |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | תמיסת מלח של בינוני |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | תמיסת מלח של בינוני |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | קבע את ריכוזי ה-DNA |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים |
| n-בוטנול | ChemSpider | 71-36-3 | משמש ל-TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | הרכיב של |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | בינוני המשמש להכנת ריאגנטים |
| אורצינולPropionic | Sigma-Aldrich | 94425 | מדגם סטנדרטי עבור SCFA |
| QIAamp DNA שרפרף מיני ערכת | QIAGEN | 51504 | לחלץ DNA גנומי חיידקי |
| אבקת PBS מוכנה לשימוש | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | A610100-0001 | משמש להכנת תרחיף השומנים |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | ציוד אנאירובי |
| רכז ואקום מהירות | LABCONCO | CentriVap | השתמש להכנת EPS |
| עמילן | Solarbio | YZ-140602 | השתמש למקור הפחמן |
| חומצה גופרתית | Sigma-Aldrich | 150692 | משמש להכנת ריאגנטים |
| T100 PCR | BIO-RAD | הגברת PCR | |
| TLC יריעות אלומיניום | MerckMillipore | 116835 | משמש ל-TLC |
| Trypticase פפטון | סיגמא-אולדריץ' | Z699209 | הרכיב של בינוני |
| טריפטון | סיגמא-אולדריץ' | T7293 | הרכיב של בינוני |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | תמיסת מלח של בינוני |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | מדגם סטנדרטי ל-SCFA |
| ויטמין K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | הרכיב של |
| מתנד מערבולת | Industries | Vortex.Genie2 | השתמש למערבולת |
| תמצית שמרים | Sigma-Aldrich | Y1625 | הרכיב של |
| בינוני ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | הרכיב של המדיום |
מקורות
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
