نقدم طريقة مفيدة للتوليف الأنزيمي على نطاق واسع وتنقية enantiomers محددة وregioisomers من ايبوكسيدات حمض الأراشيدونيك (AA)، وحمض الدوكوساهيكسانويك (DHA)، وحمض eicosapentaenoic (EPA) مع استخدام السيتوكروم البكتيرية P450 انزيم (BM3).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التوليف الأنزيمي للميتابوليت الأيبسيدية من الدوكوساهيكسانويك، إيكوسابنتانويك، وحمض الأراكيدونية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأيض epoxidized من مختلف الأحماض الدهنية غير المشبعة (PUFAs)، يطلق عليها الأحماض الدهنية الايبوكسي، لديها مجموعة واسعة من الأدوار في علم وظائف الأعضاء البشرية. يتم إنتاج هذه الأيض الذاتية من قبل فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات. بسبب آثارها البيولوجية المتنوعة والقوية، هناك اهتمام كبير في دراسة هذه الأيض. تحديد الأدوار الفريدة لهذه الأيض في الجسم مهمة صعبة, كما يجب أولاً الحصول على الأحماض الدهنية الايبوكسي بكميات كبيرة وعالية النقاء. الحصول على مركبات من المصادر الطبيعية غالباً ما تكون كثيفة العمالة، وثنائي أكسيد الذوبان (sEH) بسرعة hydrolyze الأيض. من ناحية أخرى، الحصول على هذه الأيض عن طريق التفاعلات الكيميائية غير فعالة للغاية، وذلك بسبب صعوبة الحصول على regioisomers النقي وenantiomers، وانخفاض الغلة، وواسعة النطاق (ومكلفة) تنقية. هنا، نقدم تخليق الأنزيمية كفاءةمن 19 (S)، 20 (R) - و 16 (S)، 17 (R) - الأحماض الايبوكسي (R)-الايبوكسيدوسابنتانويك (EDPs) من إدارة الشؤون الإنسانية عن طريق الايبكسيد مع BM3، وهو إنزيم CYP450 البكتيرية معزولة أصلا من عصية megaterium (التي يتم التعبير عنها بسهولة في القولونية الإشريكية). يتم إجراء التوصيف وتحديد النقاء باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، والقياس الطيفي الكتلي (MS). يوضح هذا الإجراء فوائد التوليف الأنزيمي للأيضات الايبوكسي PUFA، وينطبق على الايبوكسيال الايبوكسي الأحماض الدهنية الأخرى، بما في ذلك حمض الأراشيدونيك (AA) وحمض eicosapentaenoic (EPA) لإنتاج الايبوكسيكوساتينويك المماثل الأحماض (EETs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs)، على التوالي.
المقدمة
كما نمت الاهتمام في الدور الذي الأحماض الدهنية غير المشبعة (وخاصة أوميغا 3 وأوميغا 6 الأحماض الدهنية غير المشبعة) في البيولوجيا البشرية في السنوات الأخيرة، وقد أحاط الباحثون علما مجموعة واسعة من الفوائد الجذابة التي الأيض بهم المعرض. على وجه الخصوص، الأيض الأحماض الدهنية الايبوكسي التي تنتجها فئة P450 السيتوكروم من الإنزيمات كانت نقطة تركيز كبيرة. على سبيل المثال، تلعب العديد من الايبوكسيات الايبوكسية ، بما في ذلك الأحماض الايبوكسيكوساترينيويك (EETs) ، الأحماض الايبوكسيدوسابنتينويك (EDPs) وأحماض الايبوكسيكوساتراتينويك (EEQs) ، دورا حاسما في تنظيم ضغط الدم والتهاب1،2 , 3 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تحذير: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.
1. التعبير عن البرية من نوع BM3
- التلقيح PBS-BM3 المصابة DH5α E. القولونية (تبرع سخي من الدكتور F. آن ووكر) في 5 مل من مرق LB معقمة مع 0.5 ملغ من الأمبيسلين وأضاف في أنبوب ثقافة 20 مل.
- احتضان ثقافة الخلية في شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. إضافة ثقافة بداية بين عشية وضحاها (5 مل) و 100 ملغ من الأمبليسلين إلى 1 لتر من مرق LB معقمة في قارورة فيرنباخ أو Erlenmeyer. هز عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة، ثم عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1كروماتوغرام عمود الفلاش (الذي يتم تنفيذه باستخدام نظام تنقية الفلاش الآلي كما هو موضح أدناه) عند تنقية الخليط الخام من الأيبكسيد الأنزيمي . بعد استراتيشن وفصل regioisomers، نقية16 (S)، 17 (R)-EDP و 19 (S)، 20 (R) - EDP تم الحصول على استرات الميثيل. عادة، فهي موجودة في نسبة تقريبية 1:4 إلى 1:5، معالمنتج الرئيسي هو 19 (S)، 20 (R)-EDP. لا يتم الحصول على أي regioomers EDP أخرى (على سبيل المثال، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن نقدم هنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة من الناحية التشغيلية لإعداد اثنين من الأيض الايبوكسي الأكثر وفرة من إدارة الشؤون الإنسانية - 19،20 و 16،17-EDP. هذه الأحماض الدهنية الايبوكسي يمكن إعدادها في enantiopure للغاية (كما S، R-isomers) باستخدام الإنزيم BM3 من نوع البرية. ويرد أدناه وصف العديد من النقاط الحرجة التي يمكن استخدامها لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، وتوسيع أسلوبنا لإعداد المستقلبات الإبوكسي enantiopure AA وEPA.
إرشادات التخزين BM3
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
ويمول هذا العمل من قبل R00 ES024806 (المعاهد الوطنية للصحة)، DMS-1761320 (المؤسسة الوطنية للعلوم) وصناديق بدء التشغيل من جامعة ولاية ميشيغان. يرغب المؤلفون في شكر الدكتور جون يانغ (جامعة كاليفورنيا في ديفيس) ولاليتا كرشالا (جامعة ولاية ميتشيغان) على مساعدتهم في تحسين التفاعل الأنزيمي، والدكتور توني شيلميلر (مرفق قياس الطيف الكتلي وMetabolomics) للحصول على المساعدة في الحصول على بيانات إدارة الموارد البشرية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بيكربونات الأمونيوم | سيجما | 9830 | NA |
| أمبيسلين | جولدBio | A30125 | NA |
| كبريتات المغنيسيوم اللامائية | فيشر Scientific | M65-3 | NA |
| الميثانول اللامائي | سيجما ألدريتش | 322515 | NA |
| كبريتات الصوديوم اللامائية | فيشر Scientific | S421-500 | NA |
| اللامائية التولوين | سيجما ألدريتش | 244511 | حمض |
| الأراكيدونيك NA (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | حساس للهواء. |
| ثنائي إيثيل الأثير | سيجما | 296082 | NA |
| DMSO (درجة البيولوجيا الجزيئية) | سيجما ألدريتش | D8418 | NA |
| حمض الدوكوساهيكسانويك (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | حساسة للهواء. |
| EDTA (حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك) | Invitrogen | 15576028 | حمض |
| إيكوسابنتانويك NA (EPA) | Nu-Chek Prep | ؛ U-99A | حساسة للهواء. |
| أسيتات الإيثيل | سيجما | 34858 | NA |
| خراطيش عمود فلاش 25 ، 40 ، 4 ، 12 جم أحجام | فيشر ساينتفيك | 145170203 ، 145154064 ، 5170200 | بدلا من ذلك ، يمكن استخدام كروماتوغرافيا العمود التقليدية |
| حمض الفورميك (درجة HPLC) | جي تي بيكر | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | سيجما | L3022 | NA |
| هيدروكسيد الليثيوم | سيجما ألدريتش | 442410 | NA |
| كلوريد المغنيسيوم | فيشر Scientific | 2444-01 | NA |
| ميثانول (درجة HPLC) | سيجما ألدريتش | 34860-41-R | NA |
| NADPH ملح رباعي الصوديوم | سيجما ألدريتش | 481973 | حساس للهواء. |
| حمض الأكساليك | سيجما ألدريتش | 194131 | NA |
| pBS-BM3 المنقول DH5 & ألفا ؛ الإشريكية القولونية | NA | NA | NA |
| PMSF (فلوريد فينيل ميثان سولفونيل) | سيجما | P7626 | سامة! |
| برمنجنات البوتاسيوم | سيجما ألدريتش | 223468 | لتلوين TLC. |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة | سيجما | 795496 | NA |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | سيجما | 795488 | NA |
| Q Sepharose راتنج التدفق السريع (GE Healthcare Life Sciences) | فيشر ساينتفيك | 17-0515-01 | لتنقية تبادل الأنيون لإنزيم |
| كلوريد الصوديوم | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran ، اللامائي | سيجما ألدريتش | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M في الهكسانات) | Sigma-Aldrich | 362832 | شديد السمية. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| strong>ضروري أيضا: < / قوي > | |||
| نظام تنقية الفلاش التلقائي (استخدمنا Buchi Reveleris X2) ؛ | Buchi | ||
| C18 HPLC (Zorbax Eclipse XDB-C18) | |||
| قادر على 10,000 × جم | |||
| عمود HPLC لولبي (Lux cellulose-3) ، 250 × 4.6 مم ، 5 وميكرو ؛ م ، 1000 Å ؛) | الكيمياء العامة من Phenomenex | ||
| : قمع منفصل سعة 2 لتر ، أكواب وقوارير Erlenmeyer بسعة 1000-2000 لتر ، قوارير 20 مل ، قوارير HPLC ، قوارير صغيرة مستديرة القاع وقضبان التحريك. | |||
| HPLC (نستخدم مضخة تحليلية Shimadzu Prominence LC-20AT وكاشف SPD-20A UV-vis | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: مطياف Agilent DD2 (500 ميجاهرتز) المبخر | ||
| الدوار | Buchi | ||
| Sonic dismmembrator أو الخالط بالموجات فوق الصوتية | Cole-Parmer |
المراجع
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
