我们介绍一种用于生成双人源化BLT小鼠的新方法，该小鼠具有功能性的人类免疫系统以及稳定植入的人类类似肠道微生物组。本方案无需无菌小鼠或已知菌群动物设施即可实施。
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本文内容
摘要
摘要
具有功能性人类免疫系统的人源化小鼠（hu-mice）从根本上改变了人类病原体和疾病的研究。它们可用于模拟那些在人类或其他动物模型中难以甚至无法研究的疾病。肠道微生物组可对人类健康和疾病产生深远影响。然而，小鼠的肠道微生物组与人类的肠道微生物组存在显著差异。 目前亟需改进具有移植人类肠道微生物组的临床前人源化小鼠模型。因此，我们构建了“双人源化小鼠”（double hu-mice），其同时具备人类免疫系统和稳定的人类样肠道微生物组。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠由于其高度免疫缺陷，是进行人源化研究的最佳动物模型之一。然而，无菌NSG小鼠以及多种其他重要的无菌小鼠模型目前尚无法商业化获得。此外，许多研究机构无法获得无菌生物设施，而在无菌条件下操作通常成本高昂且耗时。重要的是，即使在微生物移植后，无菌小鼠仍存在多种免疫缺陷。因此，我们开发了一种无需使用无菌动物或无菌生物设施的实验方案。为构建双人源化小鼠，NSG小鼠在手术前接受辐射处理，以制备骨髓、肝脏和胸腺人源化（hu-BLT）小鼠。随后，小鼠接受广谱抗生素处理，以清除其原有的小鼠肠道微生物组。在抗生素处理后，通过口服灌胃方式将来自健康人类供体的粪便样本移植至小鼠体内。双人源化hu-BLT小鼠的16S rRNA基因谱特征取决于所移植的人类供体样本。重要的是，移植的人类样微生物组在双人源化hu-BLT小鼠体内保持稳定，在移植后最长可达14.5周的研究期间内未发生显著变化。
引言
人源化小鼠（hu-mice）已彻底改变了人类健康与疾病多个方面的研究，包括造血作用、免疫、癌症、自身免疫性疾病和传染病1,2,3,4,5,6,7,8,9。这类人源化小鼠相较于其他小鼠模型具有显著优势，因其具备功能性的人类免疫系统，并可感染人类特异性病原体。然而，肠道微生物组的重要性已在多种人类疾病中得到证实，如肥胖、代谢综合征、炎症性疾病和癌症10,11,12,13。黏膜免疫系统与肠道微生物组之间存在相互调控关系，以维持肠道及全身的稳态。免疫系统受肠道微生物组所呈递抗原的塑造，同时....
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方案
本文所述所有方法均按照内布拉斯加大学林肯分校（UNL）机构动物护理与研究委员会（IACUC）批准的方案进行。UNL 的 IACUC 已批准两项与生成和使用人源化 BLT 小鼠（包括双人源化小鼠）相关的方案。此外，UNL 科学研究监督委员会（SROC）也已批准在人源化小鼠研究中使用人类胚胎干细胞和胎儿组织，这些材料由 Advanced Bioscience Resources 提供（SROC# 2016-1-002）。
1. 小鼠的饲养与维护
- 购买6-8周龄的NSG小鼠（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ）。
- 将小鼠饲养在具有空气交换、预过滤器和高效微粒空气过滤器（0.22 μm）的SPF环境中，房间温度、湿度和压力均受控。
- 将小鼠饲养并维持在可进行空气交换（配备预过滤器和高效微粒空气过滤器，0.22 μm）的架系统中的灭菌独立微隔离笼具内。
- 所有小鼠操作均应在已用70%乙醇预处理的II级A2型生物安全柜中进行。进入动物房操作前，需淋浴并更换清洁的刷手服、Tyvek防护服、鞋套、头帽、口罩和手套。在进行手术操作时，应在Tyvek防护服外加穿手术 gown。
注意：操作前建议使用紫外线（UV）照射进行去污染。- 尽可能对所有器械和试剂进行高压....
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结果
图1展示了构建双人源化BLT小鼠的方法流程，并简要描述了向NSG小鼠中引入功能性人类免疫系统和稳定的人类样肠道微生物组的过程。图2展示了术后10周人源化BLT小鼠外周血的流式细胞术分析示例。图3展示了用于移植肠道微生物组以构建双人源化小鼠的人类粪便供体样本中各菌群的相对丰度。图4展示了抗生素处理对脾脏和盲肠引起的表型变化，这种变化与无菌动物中观察到的现象相似。图5展示了基于16S rRNA测序数据的主成分分析（PCA）图，显示双人源化小鼠具有与人类供体样本相对应的独特的人类样肠道微生物组。
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讨论
本文所述方案用于构建双人源化BLT小鼠，此类小鼠同时具有功能性的人免疫系统和稳定的人类肠道微生物组。该方案可适用于其他人源化或非人源化小鼠模型，且无需无菌动物和无特定病原体设施。尽管此处描述的方法相对简单，但成功构建双人源化BLT小鼠仍需注意若干关键细节。NSG小鼠免疫缺陷极为严重，预防感染是确保小鼠长期存活的关键。我们采取了以下措施以防止感染：首先，动物饲养于配备高效微粒空气（HEPA）过滤器（0.22 μm）的独立微隔离笼具中，笼架系统具备空气交换率调控功能，并置于专用动物房内。笼架的空气处理系统包含预过滤器，以及经HEPA过滤（0.22 μm）的送风与排风系统，同时对笼具排风的温度和相对湿度进行实时在线监测。其次，所有进入动物房的人员必须淋浴，并穿戴洁净的刷手服和鞋子，同时佩戴手套、一次性Tyvek防护服、鞋套、头帽和面罩。第三，所有操作（包括换笼、添加食物和水）均在II级A2型生物安全柜内进行，操作前使用70%乙醇和紫外线对安全柜进行预消毒。第四，存活手术过程中采用无菌外科技术，外科医生及助手需额外穿戴手术衣和手套等防护装备。手术在已消毒的生物安全柜中进行，仅使用无菌器械、纱布和伤口闭合材料，并在整个手术过程中维持手套和器械的无.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Yanmin Wan、Guobin Kang和Pallabi Kundu在构建BLT人源化小鼠过程中提供的帮助。我们感谢内布拉斯加大学医学中心基因组学核心实验室，该实验室获得了内布拉斯加功能基因组学研究网络（NE-INBRE P20GM103427-14）、神经感觉系统分子生物学CoBRE（P30GM110768）、Fred & Pamela Buffett癌症中心（P30CA036727）、根系与根际创新中心（CRRI 36-5150-2085-20）以及内布拉斯加研究计划的部分支持。我们感谢内布拉斯加大学林肯分校生命科学附属设施及其工作人员提供的协助。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为R01AI124804、R21AI122377-01、P30 MH062261-16A1慢性HIV感染与神经艾滋病中的衰老（CHAIN）中心，以及授予Q Li的1R01AI111862。 资助方在研究设计、数据收集与分析、稿件撰写或发表决定方面均未参与。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物喂养针头 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s 活化剂 | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s 基础液 | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 笼架 | Techniplast | ||
| 扁平棕色购物袋 3-5/8"D × 6"W × 11-1/16"L | 格雷格纳 | 12R063 | |
| FMT 上消化道递送菌群制备 | OpenBiome | FMP30 | |
| 葡萄味酷爱饮料 | 卡夫食品公司 | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| 乳酸钠林格溶液 | Boston BioProducts 公司 | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| 新孢素急救抗生素/止痛软膏 | Neosporin | ||
| NSG小鼠（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ） | 杰克逊实验室 | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G 针头 | BD | 305127 | |
| RS200 X射线辐照仪 | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 微隔离笼具 | Techniplast | ||
| 无菌非织造纱布 | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad 全球 16% 蛋白质辐照小鼠饲料 | Teklad | 2916 |
参考文献
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al.
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