Method Article

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

DOI:

10.3791/59804

⸱

September 14th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההסבר של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים סוג פראי וזנים שבו הגן של העניין שובשו. אובדן של פונקציה בעקבות הפרעה גנטית שוחזר לאחר מכן על ידי תוספת אקסודוגני של המוצר של הגן שיבש. זה עוזר לקבוע את התפקיד של הגן. שיטה שתוארה בעבר כרוכה ביצירת מתח Gtfc שיבש סטרפטוקוקוס השיזוף . כאן, שיטה בלתי תובענית מתוארת לטיהור המוצר הגנטי Gtfc מן המתח החדש שנוצר בעקבות הפרעה גנטית. זה כרוך תוספת של רצף polyhistidine-קידוד בסוף 3 ′ של הגן של עניין, אשר מאפשר טיהור פשוט של המוצר הגן באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. אין תגובות אנזימטיות מלבד ה-PCR נדרשים לשינוי גנטי בשיטה זו. השחזור של מוצר הגן על ידי התוספת אקסוסוגני לאחר הפרעה גנטית היא שיטה יעילה לקביעת פונקציה גנטית, אשר עשוי גם להיות מותאם למינים שונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים מסוג פראי לזנים בהם הגן של העניין שובשו. ברגע שהוא מופק זן גנטי, תוספת אקסוגני של המוצר הגן מאפשר שיקום פונקציונלי.

השיטה הנפוצה ביותר להשגת מוצרי גנים מטוהרים הנדרשים עבור שחזור שלאחר השחזור הוא על ידי ביצוע ביטוי הטרוולוגי בשנת הכלאיים קולי1. עם זאת, הביטוי של חלבונים הממברנה או חלבונים מסה גבוהה המולקולרי הוא לעתים קרובות קשה באמצעות מערכת זו1. במקרים אלה, חלבון היעד מבודד בדרך כלל מן התאים המהווה באופן מקורי את החלבון באמצעות סדרה מורכבת של צעדים, אשר עשוי להוביל לאובדן מוצר הגן. כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: דור של S. mutans gtfc, שבו כל אזור הקידוד של הג gtfc מוחלף עם spcr, יש להשלים לפני ביצוע פרוטוקולים אלה. עיין במאמר המתפרסם לקבלת פרטים על דור5.

1. פריימר עיצוב

  1. הכן את התחל לבניית S. מוסטנים שלו-gtfc.
    הערה: הרצפים הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה מוצגים בטבלה 1. שיטת ה-PCR של שני השלבים עבור הדור של S. מוזטאן שלו-gtfc מומחש באיור 2.
    1. עיצוב התחל (gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה) עבור הקובץ המצורף....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 מציג את הגודל של כל אמפליצין מ-pcr הראשון (איור 3a) ו-Pcr השני (איור 3a). הגודל של כל אמפליקון התכתב עם הגודל החזוי, כפי שמתואר בטבלה 1. איור 4A הופעות S. מושבות מוסדרות שינתה את המוצר השני של ה-PCR ומצופה בלוחות bhi אגר המכילים spectinomycin. מוצרי ה-PCR הושבה לאחר מכן הופעל על ג'ל הצמח (איור 4B). כל אמפליקו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיצוב התחל הוא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול. רצפי של Gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה נקבע באופן אוטומטי על בסיס רצפים של שניהם אזור סוף 3 ′ של gtfc ו 5 ′ קצה אזור של spcr. כל פריימר כולל 24 בסיסים משלימים הקודדים מקשר GS ורצף התגים שלו-coding באזורים 5 ' שלהם. שיבוש רצפי הרגולציה הילידים הממוקמים באזורים הנמצאים במעלה הזרם ניתן להימנע על ידי הוספת שלו-tag-קידוד רצפים לסוף 3 ′. את ה-DNA לעצור קודון יש להסיר מתוך ההילוך האחורי gtfcוהוסיף ל- spcr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (להעניק מספרים 16K15860 ו 19K10471 ל T. M, 17K12032 ל-M. I., ו 18K09926 ל N. H.) וקרן המדע והטכנולוגיה SECOM (SECOM) (גרנט מספר 2018.09.10 מס ' 1).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseNippon GeneticsNE-AG02לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
Anaeropackמיצובישי גז כימיA-03מערכת תרבית אנאירובית
נוגדן חד שבטי אנטי-His-Tag MBLD291-7מצומד HRP
Thermo Fisher Scientific23227מדידת ריכוז
החלבוןמרק עירוי לב מוחBecton, Dickinson237500מדיום תרבית חיידקים
CBB R-250Wako031-17922לצביעת ביופילם
יחידת אולטרה סינון צנטריפוגליתSartoriusVS2032החלפת חיץ וריכוז חלבון
צנטריפוגהKubota7780II
עמודה כרומטוגרפיתBio-Rad7321010עבור מהדק
ממברנה דיאליזהמותג פישר21-153-100
צינורות דיאליזהכאחד2-316-06
DNA פולימראזTakaraR045Aנאמנות גבוהה DNA פולימראז
ריצוף DNAEurofins גנומיקה
ECL מצעBio-Rad170-5060לכתמים מערביים
EDTA (0.5 M pH 8.0)Wako311-90075Tris-EDTA הכנת חיץ
קובטה אלקטרופורציהBio-Rad1652086פער של 0.2 ס"מ
ElectroporatorBio-Rad1652100
EtBr תמיסתNippon Gene315-90051לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
חותך להקת ג'לNippon GeneticsFG-830
ג'ל ערכת מיצויNippon GeneticsFG-91202מיצוי DNA מג'ל אגרוז
ImagerGE Healthcare29083461עבור SDS-PAGE וכתמים מערביים
ImidazoleWako095-00015הכנת מאגר מחייב ופליטה
חממהNippon Medical & מכשירים כימייםEZ-022הגדרת טמפרטורה: 4 מעלות; חממת C
Nippon Medical & מכשירים כימייםLH-100-RDSהגדרת טמפרטורה: 37 & deg; מסנן C
ממברנהMerck MilliporeJGWP047000.2 ומיקרו;
קוטר m מיקרוצנטריפוגהKubota3740
NaClWako191-01665הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה
NaH2PO4· 2H2OWako192-02815הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה
NaOHWako198-13765הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה
(NH4)2SO4Wako015-06737משקעים של אמוניום גופרתי
שרף טעון NiBio-Rad1560133עבור IMAC
פריימרים PCREurofins Genomicsבהזמנה
תקןBio-Rad161-0381עבור SDS-PAGE ו-Western Blotting
מנגנון סינון ממסכאחדFH-1G
SpectinomycinWako195-11531אנטיביוטיקה; שימוש ב-100 μ גרם/מ"ל
מסנן מזרק סטריליMerckmilliporeSLGV004SL0.22 ומיקרו; m קוטר
Streptococus mutans Δ gtfCזן מלאי במעבדה.gtfC הוחלף ב-spcr
Streptococus mutans UA159Stock במעבדה.S. mutans ATCC 700610, זן מסוג פרא
סוכרוזWako196-00015לפיתוח ביופילם
TAE (50 ופעמים; )Nippon Gene313-90035לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
ציקלר תרמיBio-RadPTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)Wako314-90065הכנת מאגר Tris-EDTA
ערכת בדיקת חלבון BCA IMAC חלבון אישית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional an....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Streptococcus mutansGene DisruptionProtein PurificationImmobilized Metal Affinity ChromatographyAmmonium Sulfate PrecipitationSDS PAGEWestern BlotElectroporationGel ExtractionPCR Amplification

Related Articles