Summary
我们提出了一个协议, 以进行动态测量气道表面液体 ph 值在薄膜条件下使用板式读取器。
Abstract
近年来, 黏膜表面 pH 值在气道中的重要性被强调为它的能力, 以调节气道表面液体 (ASL) 水合作用, 粘液粘度和抗菌肽的活性, 关键参数涉及先天防御肺。这在慢性呼吸道疾病领域具有首要意义, 如囊性纤维化 (CYSTIC), 这些参数在这些参数调控不良的情况下。虽然不同的群体在体内和体外都研究了 ASL pH 值, 但他们的方法报告了相对广泛的 ASL pH 值, 甚至是关于非 cf 和 CF 细胞之间的任何 pH 值差异的矛盾发现。此外, 它们的协议并不总是提供足够的细节, 以确保重现性, 大多数都是低吞吐量, 需要昂贵的设备或专业知识来实施, 使它们难以在大多数实验室中建立。在这里, 我们描述了一种半自动荧光板读取器检测方法, 该方法能够在与体内情况更为相似的薄膜条件下实时测量 ASL pH 值。这种技术可以同时从多种气道培养物中进行数小时的稳定测量, 重要的是, 可以监测 ASL pH 值对激动剂和抑制剂的反应。为了实现这一目标, 完全分化的原发性人气道上皮细胞 (Haec) 的 ASL 被 ph 敏感染料染色过夜, 以允许多余的液体重新吸收, 以确保薄膜条件。在使用或不存在激动剂的情况下对荧光进行监测后, 在现场进行 pH 校准, 以纠正体积和染料浓度。所述方法提供了所需的控制, 以进行稳定和可重复的 ASL pH 测量, 最终可作为个性化医学的药物发现平台, 并适应其他上皮组织和实验条件, 如炎症和/或宿主病原体模型。
Introduction
气道上皮被称为气道表面液体 (asl) 的薄 (~ 10μm) 流体层所覆盖。该 asl 的组成和深度 (水化) 受到严格的调节, 并通过粘液胆管1、2、3、4 控制气道清除的效率。近年来, ash h+/hco3含量的重要性已被不同的群体所证明, 因为它能够调节 asl 水化5, 气道炎症6和感染7, 8以及粘液粘度8,9。重要的是, 尽管存在一些争议, 但许多研究报告了哮喘10、11、12、copd11等慢性气道疾病中气道 ph 值的失调。支气管扩张11, 慢性鼻窦炎13,14和囊性纤维化 (cystic)5,9, 15,16,17,建议恢复 ASL pH 值的疗法可用于治疗多种类型的慢性气道疾病。CF 是白种人最常见的常染色体隐性遗传病, 是由于 CF 跨膜电导调节剂 (CFTR) 基因的突变引起的。这种基因编码阴离子 (hco3-和 cl-) 通道, 在离子和流体的运输和上皮细胞18的稳态中起着至关重要的作用。虽然 cf 是一种多器官疾病, 肺病理是发病和死亡的主要原因19,20, 并考虑到 cf 的主要缺陷是 cl-和hco3的运输受损-可以假设, 与没有 CF 的人相比, CF 患者的细胞外液体 pH 值会被失调, 因此, ASL pH 值的测量一直是 CF 研究的一个热点领域, 不同的群体已经开发出了测量 CF 中 ASL pH 值的技术航空公司。
在体内, 气道 ph 值是使用不同的技术测量的, 从微探针 (光纤、黄金或 mobidium 探针)5、21、22、23、24到 ph 值测量。排出的物质或呼出的呼气冷凝水 (ebc)10,11,12,25, 26,27。在 CF 的研究领域, pH 值由于其潜在的临床影响而得到了广泛的研究。从理论上讲, 使气道更碱性可以增加细菌的杀伤, 并提高粘膜的清除和气道的稳态作为一个整体。然而, 在体内/外体内研究报告了广泛的 ph 值, 到目前为止, 关于非 CF 和 cf 气道之间的 ph 值差异的结果还没有定论。在21世纪初, 不同的群体报告了 EBC 的 pH 值。在非病群中, ph 值从4.6 到8.5 不等, 但有趣的是, 在 cf12,27 的人群中, ebc ph 值在恶化过程中被发现更加酸性。最近, 在体内测量 asl 在人类和动物模型的 cf 报告了相互矛盾的结果16,17,21,22,23, 24目前仍不清楚 CF 气道是否比非 cf 气道更酸性。
由于体内测量较低的 ASL pH 值已被证明是困难的, 因为气道内的液体量非常小, 而且在疾病中可能存在粘液塞, 许多群体已转向体外实验来测量 ASL pH 值, 主要使用三种不同的方法方法。第一种方法是使用糊精偶联细胞不含硫磷的荧光染料, 这些染料作为干粉添加, 可以直接添加到 asl 中, 也可以使用称为全氟化碳 (pH-sensitive)5、8、16的惰性液体,17,28,29,30,31,32. 然而, 这种技术几乎无法控制添加到培养物中的染料的确切数量, 并存在染料聚集的风险, 以及样品和/或实验之间甚至在同一样品中的浓度存在很大差异.它一般还使用共聚焦显微镜进行, 这限制了其适用性, 在许多情况下, 防止了对多个样品的详细监测和记录条件的变化。测量 asl ph 值的第二种方法是使用 ph 敏感微电极5,15。因此, ASL pH 值测量不依赖于荧光染料浓度, 应能提供更可靠和可重现的结果。但是, 这种方法不允许对 ASL pH 值进行动态、实时测量, 也不容易在不同条件下进行多次读数。它也是一个劳动密集型、复杂的过程, 需要专门的设备 (微电极制造/电生理记录设备) 和采集样品的培训, 以便随后进行 pH 测量和校准。此外, 这两种技术在产生可重现结果的能力上也存在一些不一致之处: 使用 ph 敏感荧光染色方法, Tang 等报告了非 cf ASL 的7.35 值和 cf ASL 8 的 7.0 值。最近同一组的文献, 非 cf 和 CF 的 ASL pH 值分别为6.9 和 6.4,为 17。同样, 在2003年15年的一项研究中, 微电极测量给出了非 CF ASL 中6.4 和 CF ASL 6.1 的数值, 而同一组在2013年的一项研究中报告了非 cf asl 的6.45 值和 cf asl 的6.45 值。最后, 在第三种方法中, 研究人员在培养物的顶端 (黏膜) 表面添加了相当大的弱缓冲溶液, 从而破坏了薄膜条件, 改变了 ASL 的组成, 并有可能对其进行调节。然后使用 ph 敏感荧光染料33, 在 ussing 腔13,14 中采用 ph-统计滴定法测量 ph 值, 或者要求从培养物中去除稀释的 asl, 并使用 ph 值测量 ph 值电极、分析仪或石碑条 34。准确测量 ASL pH 值的另一个困难是建立了尽可能精确的标准曲线。事实上, 无论这些读数是用电极来测量通过树脂或使用 ph 敏感荧光染料的电势差异, 这两种方法都会受到样品的局部微环境的影响。测量。更具体地说, 染料的离解常数 (Kd) 可能会有很大的差异, 具体取决于温度、离子强度、粘度以及染料与蛋白质和潜在粘液等细胞成分的潜在相互作用。
为了尝试克服其中的许多技术问题, 以及开发一种更具活力、更简单和更高的吞吐量方法, 我们建立了一种体外技术, 使用一种不含细胞的 ph 敏感方法记录初级 hAEC 培养物中的 ASL pH 值。荧光染料在一个标准的商业制版。该方法可在薄膜条件下对完全分化的三维细胞培养物的 ASL pH 值进行可重复、动态、半自动、实时测量。通过使用多井板读取器, 这种半自动检测可以在12小时内对多达24个条件下的 pH 值进行近同时测量, 并可以监测添加各种激动剂或抑制剂的效果。本文详细介绍了该方法, 并报告了在正控制和负控制条件下验证该技术的代表性结果。
Protocol
初级非合作框架 (n = 3个捐助方, 34岁、27岁和23岁的人和 CF (n = 3个捐献者, 所有 F580del/F508del; 40岁, 41岁, 不知道) Haec 是 Scott h. randell 博士 (美国北卡罗来纳大学教堂 Marsico Lung 研究所) 送给他的礼物, 而且是 obtai根据议定书 #03-1396 批准北卡罗来纳大学教堂山生物医学机构审查委员会。这些细胞是根据以前公布的方法使用 fulcher 和 randell 35,36描述的生长和分化介质生长的。
1. 样品制备
- 如上文所述,在空气-液体界面的6.5 毫米直径半渗透支撑物 (材料表) 上生长至少 28天.
- 制备50毫升的 hco3-含krebs 缓冲液 (hco 3-krb,浓度为 mL nhaco3 (25)、kcl (5)、cal 2 (1)、mgcl 2 (1)、 d-1 glucose(5)和过滤消毒使用0.2μm 注射器过滤器。
- 如 1.135、36所述, 将底外侧培养基转化为新鲜分化培养基。
注: 已证明, 基底外侧葡萄糖浓度影响 ASL ph 33.在这一阶段, 可以通过使用已知葡萄糖浓度的缓冲溶液来控制基外侧隔间的葡萄糖含量。 - 在37°c、5% co 2 下加入150μl 的 hco3-krb , 孵育 20分钟, 将细胞的顶部表面清洗干净.
- 使用无菌玻璃巴斯德管和连接到抽吸泵的无菌 P200 管头, 在收集瓶中产生真空, 在不干扰上皮的情况下取出顶部清洗液, 而不会干扰上皮。在这个阶段, 顶端表面应该有尽可能少的液体来恢复空气-液体界面。
- 在37°c、5% CO 2 下再培养细胞30分钟。
2. 背景测量
- 打开读卡器和电脑。
- 打开仪表板。
- 点击星火 10M, 打开温度控制, 设置为37°c。打开气体控制, 并将 CO 设置为2% 至5%。
- 等到温度和二氧化碳达到目标.
- 打开读卡器抽屉, 在两侧插入充满6毫升 Dh2o的湿盒。确保盘子的盖子和底部是干净的--如果没有, 用70% 的乙醇在一块纸巾上清洗--并将盘子放在湿度盒里。
注: 在整个实验过程中, 组织培养板盖被保存在板上, 只有在添加药物或改变基外侧培养基时才将其取出, 这些培养基在组织培养层状流罩中进行, 以保持培养物处于无菌环境中。 - 打开 Spark 方法编辑器, 并在软件上设置参数, 如下所示:
- 选择合适的板模板 (对于 6.5 mm 直径的半渗透支承, 选择24井板) 和将在本实验期间进行监测的井。
- 添加温度和 CO2控制面板, 并将其分别设置为37°c 和5%。勾选温度煤气箱的等待。
- 添加一个动能循环面板, 并选择 "持续时间" 作为循环类型, 并将其设置为 5-10. 选择 "未定义为间隔类型" 以启用连续读取。
注: 连续读取的时间取决于井/条件的数量。5分钟足够长的6-12 口井, 而包含24个条件的完整板将需要10分钟的连续测量。 - 在动力学循环中, 使用拖放功能添加两个 "荧光强度" 面板, 分别用于 ph 敏感染料和 pH 敏感荧光染料。将 ph 敏感染料的激发和发射波长分别设置为560和590纳米, 对 ph 不敏感染料的激发和发射波长分别设置为495和 520 nm。
- 将每个荧光体的闪烁次数设置为 30, 将 z 位置设置为33200。
注: z 位置和增益设置取决于板式读取器的特性。手动将增益设置为一个值, 该值将提供足够高的计数, 以便拾取样本之间的差异, 但足够低, 以便添加激动剂不会产生超出检测范围的值。 - 将每个井的多读设置为定义为边框为4750μm 的3x3 大小的圆型。
- 单击 "开始" 按钮进行背景测量, 然后确定以确认湿度盒的盖子已就位。
- 测量结束后, 打开盘子读取器抽屉, 取出盘子, 将细胞放回孵化器, 同时准备荧光染料混合溶液。
- 将2μml 的1mgml 右旋偶联 ph-敏感 (phsens) 荧光染料添加到0.2μml 的10μml 糊代偶联 ph-不敏感的磷化蛋白 (phins) 荧光染料和0.8μl 无菌 hco 3-krb 的荧光染料混合溶液进行最终的制备每个条件的体积为3μl。
注: 如果有1至10个样品, 则应为 n 井 + 1 制备染料混合溶液的总体积; 如果有11至24个样品, 则应准备 n 井 + 2。糊精偶联染料在过滤无菌 hco 3-krb 溶液中重组, 在-20°c 下进行和储存。在此阶段, 任何化学品都可以在顶端表面添加16-24 小时的潜伏期37 。化学品的制备应为0.1 倍, 因为最终体积在培养后吸收多余的液体后, 将在0.3μl 左右, 用于6.5 毫米直径的半渗透支撑物。 - 小心地将3Μl 染料混合物 (见 2.8) 添加到细胞的顶端表面, 在37°c、5% CO2 处孵育过夜。
3. 动能测量
- 重复步骤2.1 至 2.4, 准备板式读取器。
- 单击 "打开" 图标, 然后选择用于背景测量的方法文件
- 在动力学循环面板中, 将环路类型保持为 "持续时间", 并将其设置为08小时。将 "间隔" 类型更改为 "固定", 并将其设置为5分钟。保持荧光强度面板与背景测量相同
注: 背景测量的间隔类型设置为 "未定义", 以允许连续读取。对于动力学和校准实验, 间隔类型设置为 "固定", 间隔为5分钟。这可以根据实验的设计和条件的数量进行调整。 - 打开读卡器抽屉;在每侧插入充满 Dh2o6毫升的湿盒。确保盘子的盖子和底部是干净的--如果没有, 用70% 的乙醇在一块纸巾上清洗--并将盘子放在带有盖子的湿盒里。
- 点击"开始"开始荧光读数。确保湿度盒盖就位后, 单击"确定" 。
- N 周期后, 通常在12到24之间, 这相当于 1到2小时, 单击 "暂停"以中断实验。取出盘子, 并应用任何药物/激动剂玄武岩横向对不同的样品。
注: 当细胞从板式读取器中取出时, CO2会逃逸, 这将导致 Asl ph 值的增加, 如 ph 敏感染料荧光的下降所示。这种二氧化碳诱导的 ph 值变化在将培养物放回板读取器后的10-15 内逆转。 - 将盘子放回托盘上的湿度盒, 重新定位湿度盒盖, 然后单击 "继续", 以进一步记录 Asl ph 值, 并监测药物/激动剂对 Asl ph 值的影响。
4. 现场 pH 校准
- 把盘子从盘子里拿出来。
- 吸出基底外侧内侧溶液。
- 分别在基外侧隔间和顶部表面加入750μl 和1μl 的高度缓冲标准曲线溶液。
注: 高度缓冲的标准曲线解包含 (mm) 氯化钠 (86)、KCl (5)、Ccl 2 (1.2 )、MgCl 2 ( 1.2)、Nahepes 或 mes 或 tris (100 mm)。使用 MES 缓冲 pH 值低于7的溶液, 用于 pH 值7-7.5 的 N三峡 pes 和 pH 值为8的溶液的 Tris。使用 HCl 将 pH 值夹紧到所需值。 - 将读卡器上的 co 2 关闭或设置为 0.1%, 然后将板放回湿度盒式磁带中。
- 设置板读取器, 其参数与前面所述相同, 但没有步骤3.2 中所述的二氧化碳.
- 开始荧光读数, 每 5分钟1-1.5 小时。
5. 评价染料浓度和悬浮液体积对校准数据的影响
- 准备足够的 ph 敏感和不敏感的染料混合物, 在3种不同的体积中至少记录4个不同 ph 值的荧光。
注: 在这里, 用26μl 的 ph 敏感点 (1 mg/mL) 和2.6μl 的 ph 不敏感 (10mg/ml) 制备了混合 1, 并将2与13μl 的 ph 敏感点 (1 mg/mL) 和1.3μl 的 ph 不敏感值 (10mgml) 混合。 - 将2.2Μl 或1.1μl 的混合1或混合2分别分配到96井板的12口井中, 并添加足够的校准解决方案, 以获得50、100或200μl 的最终体积并混合良好。
注: 在本设置中, 将记录染料浓度为 5μg/ml (200Μl)、10μg/ml (100 或 200μl)、20μgml (50 或 100μl) 或 40μgml (50 微米) 的荧光计数。 - 打开板式读卡器, 将温度设置为 37°c, 然后将板插入读卡器。不要打开 CO2控制器。
注: 由于这是一个简短的实验, 只需要足够的时间来平衡温度, 湿度盒式磁带是不需要的。 - 调整96孔板的 z 位置和增益, 并使用与半透能支承实验相同的参数。
6. 数据分析
- 将所有数据保存到电子表格并创建一个新文件。
- 在背景文件中, 为两个波长选择每个采样条件的所有平均数据, 复制并粘贴到新文件。计算每个井和每个波长的平均背景。
- 使用校准和动力学数据重复此操作, 并从每个数据点减去每个波长的背景。
- 对于每个时间点和每个样本, 计算 ph 敏感荧光和 ph 不敏感荧光之间的比率
- 如果所有样本都是从单个捐献者处获得的, 则计算校准曲线的每个时间点的比率平均值
注: 重要的是要生成尽可能多的校准曲线作为捐献者或基外侧解决方案。事实上, 这些参数会影响背景读数或流体的吸收率, 这反过来又会影响染料浓度, 从而影响计算出的 pH 值。 - 对于每个时间点, 从比率生成一个标准曲线, 绘制 x 轴上的已知 pH 值和 y 轴上的比率。
- 确定比率稳定的时间点, 拟合线性回归线, 并获取该线的方程。
- 根据动力学数据, 计算每个时间点的 pH 值, 并在 y 轴上绘制 pH 值和 x 轴上的时间
注: 在添加任何激动剂或任何其他干预措施之前, 可以通过在稳定测量 pH 值的基础值上平均数据点来计算。激动剂的作用可以通过计算治疗前后 (一定时间) 的 ph 值差异或在干预后直接将非线性曲线拟合到数据点来表征。这将提供有关 t 半值和最大值的其他信息。最后, 也可以从干预后安装到第一点的直线坡度中获得酸化或碱化率。
Representative Results
上述技术可在多达24个独立的初级 Haec 培养物中动态测量 ASL pH 值。图 1显示了主要步骤和设备设置的示意图。夜间加载的细胞被放置在一个二氧化碳和温度控制的板读取器中, 其中每5分钟记录一次来自糊精偶联 ph 敏感染料和 ph 敏感染料的荧光。
图 1: ASL pH 测量方法示意图.在清洗培养物并进行背景阅读后, 在37°c、5% CO 2 的情况下, 原发性人体气道上皮细胞 (Haec) asl 在夜间加入糊精偶联 ph 敏感染料和 ph-不敏感染料混合物。第二天, 板被转移到温度和co2 控制的板读取器和荧光从两个染料记录随着时间的推移。实验结束后, 进行了现场标定, 并对数据进行了分析, 并将其作为 ASL pH 值进行了一段时间的分析。请点击这里查看此图的较大版本.
首先, 我们研究了不同体积和染料浓度对荧光计数的影响, 因此对 560/495 比的影响。事实上, 在 ph 敏感染料中添加 ph 不敏感的染料的目的是为了纠正 ASL 负载的可变性。然而, 重要的是要测试这个假设, 并评估我们是否可以使用一个标准的校准曲线, 在没有细胞的情况下, 在96井板的所有实验和细胞类型。我们监测50、100或200μl 校准溶液中含有5、10、20或40μgml 染料的校准溶液中的荧光计数超过 1小时 (pH 值为5.5、6.5、7或 8)。结果见图 2a-c, 并表明对于相同的 ph 值和相同浓度的染料, 报告的 phsens/phins 排放比 (y 轴上的 560/95) 因体积而异 (图 2a)。此外, 在相同的 pH 值和相同体积下, 不同的染料浓度提供不同的比率值 (图 2B)。因此, 体积或染料浓度的变化将影响由排放比计算的 pH 值的绝对值。图 2C显示温度平衡所需的时间约为15-20。为了证实染料浓度和体积对排放率的影响, 我们记录了原生非 cf 和 CF Haec 在 ASL 中加载的染料的荧光。然后, 我们进行了校准, 并通过 (1) 从所有样本生成一个全局标准曲线或 (2) 为每个单元类型 (非 cf 和 CF) 生成两个独立的标准曲线来进行校准和分析结果。然后根据时间绘制这两种细胞类型的 ASL pH 值 (图 3a, b) 和平均值 (图 3A)。从单一全球标准曲线获得的 asl ph 值显示非 cf 培养物和 cf 培养物之间存在显著差异 (图 3a, c), 而在计算 ph 值时, cf 和非 cf haec 之间的 asl ph 值差别不大。独立的标准曲线 (图 3B,C)。这些结果表明, 每个实验和实验中, 每个捐献者样本生成独立的校准曲线的重要性, 因为当校准曲线平均在一起时, 在 CF 培养中发现了较高的 phsensphins 比率值。, 表示 ph 值更高 (图 3C)。
图 2: 体外 ph 校准的优化.不同体积的已知 pH 值和含有不同染料浓度的溶液被加载到96孔板上, 荧光记录在1小时以上, 体积 (a) 和染料浓度 (b) 对荧光比的影响。根据 pH 值绘制了24分钟的比率 (c) 计算了每个溶液的荧光变化斜率, 并绘制了时间函数 (以分钟为单位)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 优化了一次 Haec 在原位 pH 校准的分析 .(A) 从一个单一的标准曲线平均数据中获得的 Asl ph 值的代表性痕迹来自非 CF 和 cf 培养物。(B) 从在非 CF 或 cf 培养物上进行的独立标准曲线中获得的 Asl ph 值的代表性痕迹。每个数据集都是根据自己的校准曲线计算的。(C) 评估非 cf 培养物和 cf 培养物之间 Asl ph 值的差异, 这与校准过程的关系有关。数据代表 n一汽3实验中的平均± SEM, 双向方差分析, 西达克的多重比较试验)。请点击这里查看此图的较大版本.
为了进一步验证我们的技术, 我们需要一个积极的控制, 以证明该技术能够检测 ASL pH 值的 "预期" 变化。由于 cf 细胞中存在的酸性较高的 asl 仍有争议, 我们使用 camp 激动剂福斯科林作为阳性控制条件, 通过 cftr 刺激 hco3分泌。预期结果将显示福斯金诱导的 ASL 在非 cf 细胞中的碱化, 这将在 CF 细胞中基本减少或废除, 这取决于突变的严重程度。图 4a显示了非 CF 和 cf 细胞在一段时间内 Asl ph 值的代表性痕迹,图 4 b 显示了两种细胞类型的非氟斯高林治疗前后 asl ph 值的平均数据。我们可以从这些结果中获得不同的信息。首先, 如图 3B. c 所示, 非 cf 上皮和 cf 上皮的静息 Asl ph 值没有差异。其次, 暂停实验后的前3-4 个时间点, 用福斯科林治疗细胞, 在 ~ 15分钟内恢复的 pH 值有了很大的增加。这是由于板式读取器之间的co2浓度下降 (5%)组织培养安全柜 (~ 0%)。根据亨德森哈塞尔巴奇方程, 5% co2 环境中的 ph 值为 7, 相当于 hco3 -约 9.3 mm 的浓度。当细胞从板式读取器中取出时, 二氧化碳浓度下降到 0% 理论上会导致 Gt;8 的 ph 值增加。图 4 a显示 Asl ph 值增加到 ~ 7.8, 这可以用在板读取器中重新定位板的时间间隔 (即在5% 的 co2 环境中) 来解释。最后, 正如预测的那样, 在非 cf 培养物中, 亚基外侧10Μm 福斯科林 (Fsk) 的加入显著增加了 ASL ph 值。由于不同群体已经证明 CF 和非 cf 上皮细胞的稳态 ASL pH 值存在差异, 我们希望进一步研究实验中明显缺乏 pH 值差异的情况和 CFTR 的作用。为此, 我们用特定的 CFTR 抑制剂 CFTR inh172 (172) 预先培养非 cf培养物。如议定书第2.8 节所述, 按上述方式制备了染料混合物, 并在浓度为 0.1 x = 2μm 的情况下添加了抑制剂。根据文献, 非 cf 细胞的 ASL 高度约为10μm。因此, 在直径为 6.5 mm 的半透性支承中, ASL 的理论体积为 x3.25 2 = 0.3μl。通过在2μm 时添加3Μl 染料 + 172, 从理论上讲, 在吸收多余液体后, 抑制剂的浓度将为 20μm (1x, 所需浓度)。图4C 中的代表性痕迹和图 4C中的平均值摘要显示, 172 没有降低休息 asl ph 值, 但确实阻止了 FORSKOLIN 引起的 asl ph 值的增加, 从而证实了我们从非 cf与cf 的结果文化, 并进一步验证我们的技术。
图 4: 福斯科林对 CFTR 活化的动态 ASL ph 测量.(A) 在非 CF 和 Cf aec 中, 福斯科林 (fsk, 10μm) 随着时间的推移对 Asl ph 动力学的影响的代表性痕迹。数据表示 n一汽3实验中的平均± SEM。(B) fsk 对非 CF 和 cf 培养物中 Asl ph 值的影响摘要。数据表示 n=69 69 区域性和 35 CF 区域性 (2 路方差分析, Sidak 的多重比较测试) 中的平均值±sd。(C) CFTRinh172 (172, 20μm) 对 fsc 引起的非 cf haec 中 asl ph 值增加的影响的代表性痕迹。数据表示 n一汽5实验中的平均± SEM。172对非 cf 培养物中 fsc 诱导的 asl 碱化的影响摘要。数据代表 n一汽5实验中的平均± SEM (2 路方差分析, 西达克的多重比较试验)。请点击这里查看此图的较大版本.
最后, 如协议第6.8 节所述, 通过对干预后的初始时间点进行线性回归, 可以计算出酸化率/碱化速率。图 5 a显示, 在没有 co2 的情况下, 去除含有基外侧的 hco 3溶液(hco3-krb ) 并将其替换为 heps 缓冲溶液, 会导致asl 明显酸化。这与缺乏 hco3抑制经皮 hco 3分泌是一致的, 它允许这些气道细胞的本构质子分泌稳步降低 asl ph 值15, 17。有趣的是, 非 cf 细胞的初始酸化速率明显低于 CF 培养物 (图 5b)。
图 5: asl ph 值随 hco3-去除反应的动态变化。(A) 具有代表性的痕迹, 表明 hco3-随着时间的推移, 去除 asl ph 值对非 cf 和 cf haec 中 asl ph 值的动力学的影响。通过 hco3去除后拟合7个时间点的直线斜率获得了初始酸化速率。数据分别表示非 cf 和 CF 培养物实验中的±SEM。(B) hco3-去除后的初始酸化率摘要。数据分别表示 n一汽6和 CF 培养物 (Mann-whatney 测试) 的 n一汽6和7实验的方法± SEM。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在这里, 我们提供了一个详细的协议, 动态测量 ASL pH 在初级人气道上皮细胞。关键的步骤包括将粘液从细胞的顶端表面清洗, 使用与实验相同的参数测量和减去背景, 优化 z 位置和增益, 并进行现场 pH 校准。
清洗细胞的第一步是至关重要的, 因为厚厚的粘液层可能 (i) 防止染料到达辣椒层 (PCL), (ii) 延迟或防止检测到荧光对激动剂的反应。我们的方法是研究初级 haec 如何调节 hco 3 和 h+转运体的活性对激动剂的反应。虽然研究 PCL pH 值的变化与粘液 pH 值的变化有何关系将是一件有趣的事情, 但需要进一步发展这一协议, 包括使用不同的分子利量糊精器来区分2层和 z 扫描。整个 ASL。
背景测量是该协议的另一个重要步骤。完全分化的一次气道上皮的顶端表面很少完全平坦, 这将影响光路, 从而影响背景。确保背景读数在与实验过程中相同的井的局部点进行, 对于记录的重现性和稳定性至关重要。
优化 z 位置和增益是需要为将要使用的每种不同浓度的荧光染料设置的必要步骤。这将防止高实验间的可变性。一旦建立, 我们的检测提供稳定和可重复的结果。其中一个原因是, 染料被添加到细胞的顶端表面上的小体积液体, 很容易被上皮重新吸收, 留下一个均匀标记的 ASL。另一种在 PFC 中使用的使用干粉或 "悬浮液" 染色 asl 的方法, 虽然这可能省时 (因为实验通常在2小时内进行), 但干染料不可能在 ASL 中完全溶解, 因此可能会形成团块。因此, 在上皮细胞的表面会发现不同浓度的 ph 敏感染料。
现场 pH 校准是获得准确、可重复的结果的重要步骤。如结果部分所示和解释, ASL 体积的差异将影响荧光计数, 从而影响插值 ph 值 (图 2和图 3)。虽然不同的群体以前公布了 asl ph 值测量, 但即使在同一组8、17 公布的不同研究之间也获得了广泛的数值。我们相信, 通过进行现场校准, 结果将变得更加可重现。与其他 ph 校准技术相比, 使用高 k+/nigericin (或多个离子值) 方法生成标准曲线28、29、30, 这里介绍的分析具有以下优点:, 只要每一步都在安全柜中进行, 用于 ASL pH 值的细胞就可以清洗、保存和再用于其他实验, 前提是所进行的治疗不会对上皮细胞产生不可逆转的影响。
该方法的开发和优化提供了可重现的结果, 我们相信这种方法将有助于其他群体的 ASL pH 测量。但是, 由于设置和正在使用的单元格类型, 此技术也有一些限制。在比这里提出的更长的时间内监测 ASL pH 值 gt;8-10 可能会很困难, 因为长期的高湿度环境可能会损坏设备, 而且大多数读板器只提供在一定时间 (通常为 24小时)。使用完全分化的初级 haec 对于不同分化阶段影响 hco3和h+转运体的表达至关重要。然而, 在薄膜条件下生长的细胞中几乎不可能精确控制 ASL 的体积。如协议和结果部分所述, 体积的变化会影响荧光比, 不幸的是, 有必要假设, 在从单个细胞中生长的细胞中, 当天在不同的半渗透支持中播种, ASL 体积将是相同的。由于这一限制, 任何激动剂或抑制剂, 将影响液体分泌或吸收将影响 ASL 体积, 大概是荧光比。然而, 在我们的分析中, 校准曲线是在实验结束时执行的, 因此我们可以假定, 这些体积的变化将以与动力学实验期间相同的方式影响校准比率。出于这个原因, 我们建议有兴趣开发这种检测的团体, 使用至少2-3 个复制每个条件测试, 因为这将允许建立一个标准曲线的每个条件。
在这里, 我们提出了一个简单的, 半自动的, 分析, 允许实时测量粘膜表面 pH 在薄膜条件下。它有能力以近乎同时的方式调查许多培养物中的动态 pH 响应, 从而允许捐献者之间和捐助方内部进行比较。使用偏振系统 (HTS 96 井板)38将此方法升级为96井板格式, 作为药物发现分析, 可提供更高的吞吐量。此外, 我们已经说明了如何利用这种技术来研究激动剂对 ASL pH 值的急性影响, 我们已经表明, 这种方法可以用来研究一个顶端质子泵抑制剂对 CF Aec as39 的长期影响.由于 pH 值已被证明可以调节感染、炎症、粘液粘度和离子迁移, 因此确定可增加 pH 值的分子靶标在慢性肺病的研究领域将很有价值, 这项技术有可能促进在个性化药物方法中开展药物筛选的发展。最后, 由于酸碱稳态失调在其他疾病中发挥着重要作用, 该协议可以通过优化步骤适应不同的设备 (板阅读器) 和细胞类型, 如其他上皮细胞。细胞外酸度是癌症40,41,42的一个特征, 这种检测可以帮助确定固体肿瘤如何产生低 ph 值e或可用作低通量药物筛选试验。恢复 pH 值的稳态。同样, 至于慢性气道疾病, 它也可以为制定个性化的医学方法提供一个平台。
Disclosures
MB: 与这项工作无关: 由调查人员主导的研究金, 由辉瑞和罗氏诊断公司;诺华、罗氏诊断和 TEVA 向纽卡斯尔大学支付的演讲费。博林格英格尔海姆和顶点制药公司参加教育会议的旅费。
Acknowledgments
这项工作得到了 CF 信托战略研究中心的两项赠款 (SRC003 和 SRC013) 和一个医学研究委员会 (MRC) 对概念赠款的信心 (MC_PC_15030) 的支持。JG 得到了医学研究基金会 (MRF-091-001-RG-GARNE) 的资助。MB 得到了医学研究委员会临床科学家研究金 (mrm008797) 的支持。IH 得到了 Wellcome 信托临床培训研究金 (203520 Z/Z/Z/Z) 的支持。这项研究得到了位于纽卡斯尔医院 NHS 基金会信托基金和纽卡斯尔大学的美国国家健康研究所纽卡斯尔生物医学研究中心的支持。所表达的观点是提交人的意见, 不一定是国家医疗服务体系、国家人权研究所或卫生部的意见。Randell 博士的原代细胞得到囊性纤维化基金会赠款 (BOUCHE15R0) 和 NIH 赠款 (P30DD065988) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Starlab | E4780-1226 | |
| 6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3470 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
| CFTRInh172 | RnD Systems (Tocris) | 3430 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM |
| Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran | ThermoFisher | D22910 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
| dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran | ThermoFisher | P10361 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Forskolin | RnD Systems (Tocris) | 1099 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Cellstar | 655180 | |
| Humidity cassette | TECAN | 30090495 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| MES | Sigma Aldrich | M3885 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaHepes | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Plate reader: TECAN SPARK 10M | TECAN | 30086375 | |
| Tris | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Universal pH electrodes DJ 113 | VWR | 662-1385 |
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