يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

5.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59826

⸱

يوليو 3, 2019

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department Medicine, Johns Hopkins School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

الغرض من هذه الطريقة هو توليد القلب حقل محدد خلايا القلب السلف في المختبر من أجل دراسة مواصفات الخلية السلف والخصائص الوظيفية، وتوليد خلايا القلب غرفة محددة لنمذجة أمراض القلب.

الملخص

الخلايا الجذعية متعددة القدرات توفر إمكانات كبيرة لفهم نمو القلب والمرض والطب التجديدي. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد خلايا القلب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات، فإنه من غير الواضح ما إذا كان حقلي القلب - الأول والثاني من مجالي القلب (FHF وSHF) - مستحثة في أنظمة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. لمعالجة هذا، وضعنا بروتوكولا للمواصفات في المختبر وعزل القلب حقل محدد خلايا القلب السلف. استخدمنا خطوط الخلايا الجذعية الجنينية تحمل HCN4-GFP وTbx1-Cre; [روسا-رفب] مراسلات من ال [فهف] وال [سهف], على التّوالي, وحيّة خلية [إيمّونّينغ] من الخلية غشاء بروتين [إكسككر4], [شف] علامة. مع هذا النهج، قمنا بإنشاء خلايا السلف التي تلخص الخصائص الوظيفية والنسخ من نظرائهم في الجسم الحي. يمكن استخدام بروتوكولنا لدراسة المواصفات المبكرة والفصل في مجالي القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بالحجرة لنمذجة أمراض القلب. وبما أن هذا النظام هو في المختبر، فإنه قد لا توفر معلومات تشريحية دقيقة. ومع ذلك، فإن هذا النظام يتغلب على ضعف إمكانية الوصول إلى الأجنة في مرحلة التقطير ويمكن رفعها للشاشات عالية الإنتاجية.

المقدمة

وقد أحدث استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) ثورة في مجال تجديد القلب والطب الشخصي مع الخلايا النخاعية الخاصة بالمريض لنمذجة الأمراض والعلاجات الدوائية1،2،3، 4.في الآونة الأخيرة, في المختبر وقد وضعت بروتوكولات لتوليد الأذيني مقابل البطين وكذلك منظم ضربات القلب مثل PSC-مشتقات خلايا القلب 5,6. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن إعادة تكوين القلب في المختبر لدراسة نمو القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بغرفة البطين لا يزال غير واضح.

خلال النمو الجنيني المبكر، الخلايا الجلدية تحت تأثير مورفيوجينات مفرزة مثل BMP4، Wnts وActivin A شكل سلسلة البدائية7. خلايا القلب الأدمة التي تميزت بالتعبير عن Mesp1، تهاجر بشكل أمامي وأخير لتشكيل الهلال القلبي ثم أنبوب القلب البدائية7،8. هذه المجموعة المهاجرة من الخلايا تشمل اثنين من السكان متميزة جدا من خلايا السلف القلبية (CPCs)، وهما حقل القلب الأول والثاني (FHF وSHF)9،10. الخلايا من SHF هي تكاثرية للغاية والهجرة وهي مسؤولة في المقام الأول عن اطالة وحلقة من أنبوب القلب. بالإضافة إلى ذلك، خلايا SHF تفرق لخلايا القلب والخلايا الليفية والعضلات الملساء والخلايا البطانية عند دخولها إلى أنبوب القلب لتشكيل البطين الأيمن، والقناة الهوائية اليمنى والجزء الأكبر من كلا الأذين7،10. وعلى النقيض من ذلك، خلايا FHF هي أقل تكاثرية والهجرة وتفرق أساسا لخلايا القلب كما أنها تؤدي إلى البطين الأيسر وجزء أصغر من الأذين11. وعلاوة على ذلك، تتميز السلف SHF من خلال التعبير عن Tbx1، FGF8، FGF10 و Six2 في حين أن الخلايا FHF التعبير عن HCN4 و Tbx511،12،13،14،15.

يمكن لـ PSCs التفريق بين الطبقات الجرثومية الثلاث وبالتالي إلى أي نوع من الخلايا في الجسم4و16 . ولذلك، فإنها توفر إمكانات هائلة لفهم نمو القلب ونمذجة عيوب نمو محددة تؤدي إلى أمراض القلب الخلقية، والسبب الأكثر شيوعا للعيوب الخلقية17. مجموعة كبيرة من أمراض القلب الخلقية تشمل تشوهات القلب الخاصة بغرفة18,19. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه تنبع من تطور حقل القلب الشاذة. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لعدم قدرة خلايا القلب في الانتشار بعد الولادة، كانت هناك جهود واسعة النطاق لخلق أنسجة القلب لتجديد القلب1،7،20. وبالنظر إلى الاختلافات الفسيولوجية والمورفولوجية بين غرف القلب، فإن توليد أنسجة القلب الخاصة بالحجرات باستخدام مراكز الأمن العام أمر ذو أهمية كبيرة. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد قوي من خلايا القلب من مراكز الأمن العام، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان يمكن أن يسبب هاتي في مجالي القلب في أنظمة PSC.

لتلخيص توليد القلب في المختبر ودراسة مواصفات وخصائص CPCs، استخدمنا سابقا نظام يستند إلى تمييز SPHeroids القلب المشتقة PSC21،22،23،24. في الآونة الأخيرة، قمنا بإنشاء الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) مع GFP ومراسلي RFP تحت سيطرة الجين HCN4 FHF وجين SHF Tbx1، على التوالي (mESCsTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP) 25. في المختبر mESCs متباينة شكلت كرويات القلب التي GFP + وخلايا RFP + ظهرت من منطقتين متميزتين من الخلايا الأدمية ومنقوشة بطريقة تكميلية. وأظهرت الخلايا الناتجة عن ذلك GFP+ وRFP+ خصائص FHF وSHF، على التوالي، التي تحددها التحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي والتحليلات الكلونية. الأهم من ذلك، باستخدام mESCs تحمل مراسل Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP)،اكتشفنا أن خلايا SHF تميزت بإخلاص من قبل بروتين سطح الخلية CXCR4، وهذا يمكن أن تمكن عزل خلايا القلب الميدانية الخاصة دون transgenes. وسيصف هذا البروتوكول توليد وعزل مراكز القلب الأساسية الخاصة بحقول القلب عن الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم، مما قد يكون بمثابة أداة قيمة لدراسة أمراض القلب الخاصة بالحجرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: في المختبر جيل من خلايا القلب القلب القلب حقل محدد (الشكل 1).

1- صيانة المعدات الاستراتيجية للفأرة

  1. النمو في الشركات الصغيرة والمتوسطة (mESCsTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP، mESCIsl1-RFP)25 على 0.1٪ (ث / الخامس) الجيلاتين المغلفة T25 قوارير في 2I المتوسطة (870 مل من الحد الأدنى من الغلاسكاو المتوسطة الأساسية (GMEM)، 100 مل من مصل الأبقار الجنين (FBS)، 10 مل من الجلوتاماكس، 10 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 10 مل من الصوديوم بيروفات، 3 ميكرولتر من بيتا-ميركابتوثانول، 20 ميكرولتر من ليف (200 U/mL)، 0.3 ميكرومتر CHIR99021 و 0.1 μM PD0325901).
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70-80٪، شطف الخلايا مرة واحدة مع حل الفوسفات العازلة (PBS) ثم ينقسم إلى خلايا واحدة عن طريق إضافة 1 مل من التريبسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  3. تحييد التربسين عن طريق إضافة 4 مل من FBS 10٪ في تعديل النسر المتوسط دولبيكو (DMEM). عد الخلايا باستخدام عداد خلية مؤتمتة.
  4. جهاز طرد مركزي ~ 3 x 105 خلايا لمدة 3 دقائق في 270 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
  5. ازه النوافي، وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من 2I المتوسطة وإعادة صفي على 0.1٪ (ث / الخامس) الجيلاتين المغلفة T25 قوارير للصيانة.

2. جيل من خلايا القلب الاستباقية باستخدام كرويات القلب

  1. جهاز الطرد المركزي 2.5 x 106 خلايا من الخطوة 1.3 لمدة 3 دقائق في 270 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
  2. ازه النوافيون وإعادة تعليق الخلايا في 25 مل من المتوسط SFD (105 خلايا / مل). اعتمادا على حجم التجربة، يمكن تعديل عدد mESC وفقا لذلك.
    ملاحظة: يحتوي المتوسط SFD 715 مل من المتوسط دولبكو تعديل Iscove (IMDM)، 250 مل من F12 لحم الخنزير، 5 مل من N2-الملحق، 10 مل من B27 ناقص فيتامين A، 5 مل من 10٪ (ث / في) BSA (في PBS)، 7.5 مل من الجلوتاماكس و 7.5 مل من البنسلين-ستربتوميوسين. إضافة حمض الاسكوربيك (50 ملغ / مل) و 3.9 X 10-3٪ (v/ v) من مونوثيوجليسيرول قبل استخدام.
  3. لوحة تعليق الخلية في واحد 150 مم × 25 ملم لوحة معقمة واحتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة ل48 ح. يجب أن تتشكل كرويات القلب في غضون 24 ساعة.
  4. جمع جميع كرويات القلب شكلت والطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 145 x ز ودرجة حرارة الغرفة لعزل بشكل انتقائي الكرويدات وتجنب الخلايا المفردة.
  5. استنشق الـ supernatant ويعاد تعليق الكرويات في 25 مل من المتوسط SFD مع 1 نانوغرام / مل من أكتيفين A و 1.5 نانوغرام / مل من BMP4 للحث التفريق. لوحة الكروية في نفس 150 مم × 25mm لوحة معقمة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة لمدة 40 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام تركيزات مختلفة من أكتيفين A (0-3 نانوغرام/مل) وBMP4 (0.5-2 نانوغرام/مل) لتحسين التمايز اعتماداً على خط mESC.
  6. جمع جميع كرويات القلب والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 145 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
  7. ازه ال [سوبرنتنت] و [رلّوب] ال [كرويرويدس] في 25 [مل] من [سفد] متوسّطة. نقل EBs إعادة تعليق في مرفق منخفض جدا 75 سم2 قارورة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة لمدة 48 ساعة.

3. عزل القلب حقل خلايا محددة القلب Progenitor باستخدام مراسلين الفلورسنت

  1. جهاز طرد مركزي كروي القلب في 145 x ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 min وينشق supernatant. أضف 1 مل من التربسين واحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  2. إضافة 4 مل من FBS 10٪ في DMEM إلى تعطيل التربسين وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب. لإزالة الخلايا غير المنفصلة، قم بتصفية المزيج باستخدام مصفاة 70 مم والطرد المركزي للخلايا الفلسمدة لمدة 3 دقائق عند 270 x غ ودرجة حرارة الغرفة.
  3. (ج) فرز الـ CPCs التي تحمل مراسلين فلوريين (CPCs المستمدة من الشركات الصغيرة والمتوسطةTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP)،يستنشق supernatant وإضافة 500 μL من حل فرز FACS (1٪ (v/v) FBS، 200 m HEPES و 10 m M من EDTA في PBS) لإعادة تعليق.
  4. لإزالة جميع مجموعات الخلايا قبل الفرز، قم بتصفية الخلايا مرة أخرى باستخدام أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل مع مصفاة خلايا 40 ميكرومتر. إبقاء الخلايا على الجليد حتى الفرز.
  5. فرز الخلايا لعزل Tbx1-Cre; روزا-RFP وHCN4-GFP CPCs إيجابية باستخدام فارز خلية المنشط الفلورسنت (FACS). جمع الخلايا فرزها في 1 مل من FBS. احتفظ بالعينة الخلوية والخلايا المفرزة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

4. عزل القلب حقل محدد خلايا القلب Progenitor باستخدام Cxcr4 كعلامة بروتين سطح الخلية

  1. لعزل أول مقابل الثانية القلب حقل CPCs على أساس التعبير عن مستقبلات البروتين السطحي Cxcr4، استخدم خط mESCIsl1-RFP. انشر الـ supernatant من الخطوة 3.3 واعيد تعليق الـ CPCs المفردة في 300 ميكرولتر من 10% من الـ FBS في PBS التي تحتوي على 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 مترافق مع الأجسام المضادة Cxcr4.
  2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min ويغسل عن طريق إضافة 1-2 مل من PBS الباردة. جهاز طرد مركزي لـ CPCs واحد لمدة 3 دقائق في 270 x ز ودرجة حرارة الغرفة وغسل مرتين أخرى تليها الطرد المركزي.
  3. ازه الـ supernatant وأضف 500 ميكرولتر من حل فرز FACS لإعادة تعليق CPCs واحد وتصفية كما هو الحال في الخطوة 3.4.
  4. عزل Cxcr4 + و Cxcr4-الخلايا باستخدام FACS. جمع الخلايا فرزها في 1 مل من FBS. احتفظ بالعينة الخلوية والخلايا المفرزة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

5. تحليل الخلايا القلبية محددة القلب حقل محدد

  1. جهاز الطرد المركزي فرز تمركز اتوى لمدة 3 دقائق في 270 × ز ودرجة حرارة الغرفة. يمكن استخدام الخلايا المنسّقّة لتحليلات تعبير الجينات والبروتين أو يمكن إعادة زرعها لإجراء التحليلات في وقت لاحق.
  2. لإعادة زرع CPCs معزولة، يستنشق supernatant، إعادة تعليق الخلايا في المتوسط SFD وإعادة صفيحة ~ 3 X 104 خلايا في البئر من لوحة 384-البئر المغلفة مع 0.1% (ث / الخامس) الجيلاتين.  إذا لوحظت زيادة موت الخلية بعد الفرز، أضف 10 ميكروم من Y-27632 (مثبط اتّج) إلى العينة. وبعد يومين من إعادة الزراعة، ينبغي ملاحظة الضرب التلقائي.
  3. لتحليل قدرة CPCs مطلي للتمييز لخلايا القلب، وجمع الخلايا في اليوم 12 من التمايز. استخدام التربسين كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.5 لعزل CMs واحد.
  4. طرد مركزي الخلايا لمدة 3 دقائق في 895 x ز، ودرجة حرارة الغرفة. ازهر الـ supernatant وإعادة تعليق الخلايا في PBS لغسل PFA. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  5. ازهر النوافيون وإعادة تعليق الخلايا في 10٪ FBS في PBS. احتضان نصف عينة الخلية مع الأجسام المضادة للماوس تي مكافحة Troponin (1:500) واستخدام بقية العينة كتحكم سلبي. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل الخلايا مرتين كما هو موضح في الخطوة 5.4 باستخدام PBS. استنشق supernatant وإعادة تعليق كل من عينات الخلية في FBS 10٪ في PBS مع 1:500 حمار المضادة للماوس IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية، اليكسا فلور 647 متقارن. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. غسل مرتين مع PBS كما في الخطوة 5.6. ازهر النوافيون ويعاد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS. استخدام السيتومتر تدفق لتحليل الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وبعد ما يقرب من 132 ساعة من التمايز، يمكن الكشف عن Tbx1-RFP وHcn4-GFP CPCs باستخدام المجهر الفلورسنت (الشكل2). بشكل عام، GFP وRFP تظهر الخلايا تقريبا في نفس الوقت. ولا يزال السكان في مراكز اللاجئين يتوسعون على مقربة من بعضهم البعض ونمطا تكميليا. إن ضبط تركيزات أكتيفين أ وBMP4 سيغير النسب المئوية لـFHF مقابل مراكز المعالجة بالموجات فوق الـ SHF (الشكل 3). تم تحديد مواصفات التصنيف المركزي للمنتجات في المختبر في المقام الأول من خلال تركيز BMP4. ولذلك، يمكن استخدام ن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في بروتوكولنا، فإننا نوصف منهجية لتوليد كرويات القلب والقلب معزول حقل مراكز المعالجة بالقلب. ويمكن استخدام هذه الآليات لدراسة آليات مواصفات CPC وخصائصها، وكذلك لنمذجة الأمراض الخاصة بغرفة القلب. واحدة سابقا نشر عمل استعمل [مسك] خطّ مع اثنان [فلسنت] مراسلات ([مف2ك/نكإكس2.5]) أن يدرس [كرديوجنسس] في مختبر, مهما, عبّر عن كلا أنّ علامات في يوم جنينيّة 9.5-10 عندما [كرديوووسكتس] يكون سابقا شكّلت26. على حد علمنا، لا توجد حاليا أي طرق لعزل القلب في مجال محدد من مراكز المعالجة القلبية الاستراتيجية في المخت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يملك أصحاب البلاغ أي شيء للكشف عن المعلومات.

شكر وتقدير

E. T. كان مدعوما من قبل السحر الذي يهم وAHA. C. K. كان مدعوما من قبل المنح من NICHD/NIH (R01HD086026)، AHA، وMSCRF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
& بيتا ؛ ميركابتو إيثانولسيجماM6250
0.1٪ (وزن / حجم) الجيلاتينEMD MilliporeES-006-B
100 ملي مولار بيروفات الصوديومجيبكو11360
100x القلم / البكتيرياGibco15070-063
1x PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيومالحرارية فيشر العلمية21-040-CV
20٪ بارافورمالدهايدثيرمو فيشر العلمي50-980-493
5 مل أنبوب دائري القاع من البوليسترين مع 40 & mu ؛ مصفاة الخلايا المتحركةBD Falcon35223
Activin AR & أنظمة D338-AC-010
حمض الأسكوربيكسيجماA-4544
B27 ناقص فيتامين أ (50x)12587010ثيرمو فيشر العلمي
BMP4R & D Systems314-BP
مصل الأبقار الألبومينSigmaA2153
فارز الخلاياSonySH800Sony أو أي فارز خلوي آخر منشط
بالفلورة مصفاة الخلية 70 & mu ؛ مثيرمو فيشر العلمي08-771-2
أجهزة الطرد المركزي سورفال ليجند XTثيرمو فيشر75004508 CHIR99021
سيليك للكيماوياتS2924
CO2< / sub> حاضنةثيرمو فيشر العلمي51030285
كورنينج مرفق منخفض للغاية T75 قارورةكورنينج07-200-875
عدد لا يحصى من عداد الخلايا الآلي II FLIgG المضاد للفأر
، Alexa Fluor 647 المترافقThermo Fisher ScientificA-31571 ، Lot # 1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium High Glucose (DMEM)Gibco11965-092
EDTASigmaE6758
ESGRO (LIF)MilliporeESG1106
EVOS FL المجهرThermo Fisher ScientificAMF4300
مصل الأبقار الجنينيInvitrogenSH30071.03
غلاسكو ' s MEM (GMEM)جيبكو11710035
جلوتا ماكس (100x)جيبكو35050-061
لحم الخنزير s F12Gibco10-080-CV
HEPESSigmaH3375
IMDMGibco12440053
Monothioglycero (MTG)SigmaM-6145
الفأر المضاد للتروبونين T الجسم المضادثيرمو فيشر العلميMS-295-P1
N2-SUPPLEMENTGibco17502-048
غير ضروري محلول الأحماض الأمينية (NEAAInvitrogen11140-050
PD0325901SelleckchemS1036
PerCP-efluor 710 الجسم المضاد المترافق المضاد ل Cxcr4Thermo Fisher Scientific46-9991-82
طبق ثقافة التعليق 150 مم × 25مم قوارير Corning430597
T25Corning353109
TrypLE (Trypsin)جيبكو12604
Y-27632 (مثبط ROCK)تقنيات الخلايا الجذعية72304
الجسم المضاد الثانوي

المراجع

  1. Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  2. Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  3. Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  6. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  7. Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
  8. Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
  9. Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292(2013).
  10. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
  11. Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
  12. Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
  13. Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
  14. Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
  15. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  16. Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
  17. Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
  18. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
  19. Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
  20. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  21. Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413(2012).
  22. Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
  23. Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164(2014).
  24. Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
  25. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140(2018).
  26. Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

خلايا سلف حقل القلبخلايا جذعية جنينيةمقايسة المراسل الفلوريتحليل قياس التدفق الخلويبروتوكول عزل الخلاياتكوين كرويات قلبيةفرز الخلايا بتقنية FACSعلامة السطح Cxcr4مراسل Hcn4-GFP
في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.