Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В vitro Поколение мыши сердце поле конкретных сердечных клеток-прародителей

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59826

⸱

3 июля 2019 г.

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department Medicine, Johns Hopkins School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого метода состоит в том, чтобы генерировать сердце поле конкретных клеток-прародителей в пробирке для того, чтобы изучить спецификации клеток-прародителей и функциональные свойства, а также для создания камерных конкретных сердечных клеток для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки предлагают большой потенциал для понимания развития сердца и болезней и для регенеративной медицины. Хотя последние достижения в области развития кардиологии привели к генерации сердечных клеток из плюрипотентных стволовых клеток, неясно, если два сердечных полей - первое и второе сердце поля (FHF и SHF) - индуцируются в плюрипотентных стволовых клеток систем. Для решения этой проблемы мы создали протокол для спецификации in vitro и изоляции клеток сердечного полевого декабриста. Мы использовали эмбриональные линии стволовых клеток, несущие Hcn4-GFP и Tbx1-Cre; Роза-RFP репортеров FHF и SHF, соответственно, и живые клетки иммуно-сточки клеточного белка cxcr4, маркер SHF. При таком подходе мы создали клетки-прародители, которые переизбавляли функциональные свойства и транскриптом их аналогов in vivo. Наш протокол может быть использован для изучения ранней спецификации и сегрегации двух сердечных полей и для создания камерных клеток сердца для моделирования сердечных заболеваний. Так как это в пробирке органоидной системы, он не может обеспечить точную анатомическую информацию. Тем не менее, эта система преодолевает низкую доступность эмбрионов ступенчатой стадии и может быть высококлассным для высокопроизводительных экранов.

Введение

Использование плюрипотентных стволовых клеток (PSCs) произвелреволюцию в области регенерации сердца и персонализированной медицины с конкретными миоцитами для пациентов для моделирования заболеваний и медикаментозной терапии1,2,3, 4. Совсем недавно, в пробирке протоколы для генерации предсердий против желудочков, а также кардиостимулятор, как PSC полученных кардиомиоцитов были разработаны5,6. Однако, может ли кардиогенез быть воссоздан в пробирке для изучения развития сердца и последующего создания желудочковых камер-специфических сердечных клеток до сих пор неясно.

Во время раннего эмбрионального развития, мезодермальные клетки под влиянием секретных морфогенов, таких как BMP4, Wnts и Activin A образуют примитивную полосу7. Сердечные мезодермальные клетки, отмеченные выражением Mesp1, мигрируют передним и в последнее время, чтобы сформировать сердечный полумесяц, а затем примитивную сердечную трубку7,8. Эта мигрированная группа клеток включает в себя две очень разные популяции клеток-прародителей сердца (КПК), а именно первое и второе поле сердца (FHF и SHF)9,10. Клетки из SHF являются высоко пролиферативными и мигрирующими и в первую очередь отвечают за удлинение и петлю сердечной трубки. Кроме того, SHF клетки дифференцируются к кардиомиоцитов, фибробластов, гладких мышц и эндотелиальных клеток, как они входят в сердечную трубку, чтобы сформировать правый желудочек, правый желудочковой оттока и большую часть обоих предсердий7,10. В отличие от этого, клетки FHF менее пролиферативной и мигрирующих и дифференцировать в основном кардиомиоцитов, поскольку они приводят к левому желудочку и меньшая часть предсердий11. Кроме того, shF прародители отмечены выражением Tbx1, FGF8, FGF10 и Six2 в то время как клетки FHF выражают Hcn4 и Tbx511,12,13,14,15.

PSCs может дифференцировать к всем 3 слоямзародыша и затем к любому типу клетки в теле 4,16. Таким образом, они предлагают огромный потенциал для понимания развития сердца и для моделирования конкретных дефектов развития, приводящих к врожденным порокам сердца, наиболее частой причиной врожденных дефектов17. Большая подгруппа врожденных пороков сердца включает камерно-специфические сердечные аномалии18,19. Тем не менее, до сих пор неясно, являются ли они происходят из аномальной разработки поля сердца. Кроме того, учитывая неспособность кардиомиоцитов размножаться после рождения, были предприняты значительные усилия посозданию сердечной ткани для регенерации сердца 1,7,20. Учитывая физиологические и морфологические различия между сердечными камерами, генерация камерной сердечной ткани с использованием ПСК имеет важное значение. Хотя последние достижения в области развития кардиологии привели к надежной генерации сердечных клеток из PSCs, до сих пор неясно, если два сердца поля могут быть индуцированы в системах PSC.

Для повторения кардиогенеза in vitro и изучения спецификации и свойств КПК, мы ранее использовали систему, основанную на дифференциации PSC полученных сердечных сфероидов21,22,23,24. Недавно мы создали эмбриональные стволовые клетки мыши (mESCs) с GFP и RFP репортеров под контролем гена FHF Hcn4 и гена SHF Tbx1, соответственно (mESCsTbx1-Cre; Роза-РФП; HCN4-GFP) 25. В пробирке дифференцированные mESCs образуются сердечные сфероиды, в которых GFP и RFP' клетки появились из двух различных областей мезодермальных клеток и узорчатые в комплементарной манере. В результате клетки ГФПЗ и ПФР, проявляющие соответственно характеристики FHF и SHF, определяемые анализами РНК-секвенирования и клонального анализа. Важно отметить, что с помощью mESCs проведения Isl1-RFP репортер (mESCIsl1-RFP), мы обнаружили, что SHF клетки были точно отмечены клеточной поверхности белка CXCR4, и это может позволить изоляцию сердца поля конкретных клеток без трансгенов. В настоящем протоколе будет описано генерация и изоляция сердечных полевых КТК от МСК, которые могут служить ценным инструментом для изучения камерных сердечных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: В пробирке поколения сердца поле конкретных клеток сердца клеток-прародителей(Рисунок 1).

1. Обслуживание мыши ESCs

  1. Рост mESC (mESCsTbx1-Cre; Роза-РФП; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 на 0,1% (w/v) желатина покрытием T25 колбы в 2i средних (870 мл глазной минимальной необходимой среды (GMEM), 100 мл сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 10 мл натрия, 10 мл натрия пирувате, 3 л бета-меркаптоэтанола, 20 л лифа (200 U/mL), 0,3 мкм CHIR99021 и 0,1 мкм PD025901).
  2. Когда клетки достигают 70-80% слияния, промыть клетки один раз с фосфатным буферным раствором (PBS), а затем разъединить на одиночные клетки, добавив 1 мл трипсина и инкубации при 37 градусов по Цельсию в течение 3 мин.
  3. Нейтрализовать трипсин, добавив 4 мл 10% FBS в Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM). Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  4. Центрифуга 3 х 105 клеток в течение 3 мин при 270 х г и комнатной температуре.
  5. Аспирируйте супернатант, resuspend клетки в 5 мл 2i средних и replate на 0,1% (w/v) желатина покрытием T25 колбы для обслуживания.

2. Поколение сердечных клеток-прародителей с использованием сердечных сфероидов

  1. Центрифуга 2,5 х 106 клеток от шага 1,3 на 3 мин при 270 х г и комнатной температуре.
  2. Приготовьте супернатант и повторно остановите клетки в 25 мл среды SFD (105 ячеек/мл). В зависимости от масштаба эксперимента, номер mESC может быть соответствующим образом скорректирован.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SFD среда содержит 715 мл исковского модифицированного Dulbecco в среднем (IMDM), 250 мл F12 ветчины, 5 мл N2-добавки, 10 мл B27 минус витамин А, 5 мл 10% (w/v) BSA (в PBS), 7,5 мл GlutaMAX и 7,5 мл пенициллина-стрептомицина. Добавьте аскорбиновую кислоту (50 мг/мл) и 3,9 х 10-3%(v/v) монотиоглицерола до использования.
  3. Плита клеточной подвески в один 150 мм х 25 мм стерильной пластины и инкубировать при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатор для 48 ч. Сердечные сфероиды должны быть сформированы в течение 24 ч.
  4. Соберите все сформированные сердечные сфероиды и центрифугу в течение 3 мин при 145 х г и комнатной температуре, чтобы выборочно изолировать сфероиды и избежать одиночных клеток.
  5. Приготовьте супернатант и отразите сфероиды в 25 мл среды SFD с 1 нг/мл Activin A и 1,5 нг/мл BMP4 для индукции дифференциации. Плита сфероидов в той же 150 мм х 25 мм стерильной пластины и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатор для 40 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные концентрации Activin A (0-3 нг/мл) и БМП4 (0,5-2 нг/мл) могут быть использованы для оптимизации дифференциации в зависимости от линии mESC.
  6. Соберите все сердечные сфероиды и центрифугу в течение 3 мин при 145 х г и комнатной температуре.
  7. Приготовьте супернатант и отразите сфероиды в 25 мл среды SFD. Перенесите переплетить взвешенные ЭБ в ультра-низком вложении 75 см2 колбы и инкубировать их при 37 градусах Цельсия в инкубаторе CO 2 5% CO2 в течение 48 ч.

3. Изоляция сердца поле специфических сердечных клеток-прародителей с использованием флуоресцентных репортеров

  1. Центрифуга сердечных сфероидов на 145 х г и комнатной температуры в течение 3 минут и аспирации супернатанта. Добавить 1 мл трипсина и инкубировать при 37 градусах По Цельсию в течение 3 мин. Хорошо перемешайте, чтобы разъединить клетки.
  2. Добавьте 4 мл 10% FBS в DMEM, чтобы инактивировать трипсин и хорошо перемешать путем пипеттинга. Чтобы удалить неотделимые ЭБ, отфильтруйте смесь с помощью 70-мм ситеча и центрифуги фильтруйте фильтрованные клетки в течение 3 мин при температуре 270 х и комнатной температуре.
  3. Для сортировки КПк, перевозящих флуоресцентные репортеры (КТК, полученные от mESCsTbx1-Cre; Роза-РФП; HCN4-GFP), аспирировать супернатант и добавить 500 л сортировки раствора FACS (1% (v/v) FBS, 200 мМ HEPES и 10 мМ EDTA в PBS), чтобы приостановить.
  4. Чтобы удалить все кластеры клеток до сортировки, фильтруем клетки снова с помощью 5 мл полистирола кругло-дно трубки с 40 мкм ячейки ситечко. Держите клетки на льду до сортировки.
  5. Сортировать клетки, чтобы изолировать Tbx1-Cre; Роза-РФП и HCN4-GFP положительные КПК с помощью флуоресцентного активированного сортировки клеток (FACS). Соберите отсортированные ячейки в 1 мл FBS. Держите образец клетки и отсортированные клетки при 4 градусах Цельсия.

4. Изоляция сердца поле специфически сердечных клеток-прародителей использование Cxcr4 как маркер белка поверхности клетки

  1. Чтобы изолировать первое против второго поля сердца КПК на основе экспрессии поверхностного рецептора белка Cxcr4, используйте линию mESCIsl1-RFP. Аспирировать супернатант со ступени 3.3 и resuspend одного КПК в 300 Л 10% FBS в PBS, содержащий 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 конъюгированных анти-Cxcr4 антитела.
  2. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут и промыть, добавив 1-2 мл холодного PBS. Центрифуги один Очных лиц в течение 3 мин при температуре 270 х и комнатной температуре и мыть еще два раза с последующим центрифугированием.
  3. Аспирировать супернатант и добавить 500 Зл раствора сортировки FACS, чтобы повторно приостановить один Очных атлетов и фильтр, как в шаге 3.4.
  4. Изолировать Cxcr4 и Cxcr4- клетки с помощью FACS. Соберите отсортированные ячейки в 1 мл FBS. Держите образец клетки и отсортированные клетки при 4 градусах Цельсия.

5. Анализ изолированных сердечных полевых специфических клеток-прародителей

  1. Центрифуга отсортирована КТК в течение 3 мин при температуре 270 х г и комнатной температуре. Сортированные клетки могут быть использованы для анализа экспрессии генов и белков или они могут быть рекультурными для анализа в более поздние моменты времени.
  2. Чтобы перекультуры изолированных КПК, аспирировать супернатант, resuspend клетки в среде SFD и replate 3 х 104 клетки на хорошо 384-колодец пластины покрыты 0,1% (w/v) желатин.  Если после сортировки отмечается повышенная гибель клеток, добавьте в образец 10 мкм Y-27632 (ингибитор ROCK). Через два дня после рекультуры следует отметить спонтанное избиение.
  3. Для анализа способности покрывало КПК дифференцироваться к кардиомиоцитам, собирать клетки на 12-й день дифференциации. Используйте трипсин, как описано в шагах 1.2-1.5 для изоляции одного CMs. Resuspend клетки в 4% (w/v) параформальдегид (PFA) и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы исправить клетки.
  4. Центрифуги клетки в течение 3 мин при 895 х г, и комнатной температуры. Аспирировать супернатант и resuspend клетки в PBS для мытья PFA. Повторите этот шаг еще раз.
  5. Аспирируй супернатант и resuspend клетки в 10% FBS в PBS. Инкубировать половину образца клетки с мышью анти-Тропонин T антитела (1:500) и использовать остальную часть образца в качестве отрицательного контроля. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
  6. Вымойте клетки в два раза, как описано в шаге 5.4 с помощью PBS. Аспирировать супернатант и resuspend обоих образцов клеток в 10% FBS в PBS с 1:500 осла анти-мышь IgG (H'L) вторичное антитело, Alexa Fluor 647 конъюгированный. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
  7. Вымойте дважды с PBS как в шаге 5.6. Аспирируй супернатант и повторно приостанавливая клетки в 200 Л PBS. Используйте цитометр потока для анализа клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После примерно 132 ч дифференциации, Tbx1-RFP и Hcn4-GFP CpCs могут быть обнаружены с помощью флуоресцентного микроскопа(рисунок 2). Как правило, ячейки GFP и RFP появляются примерно в одно и то же время. Две популяции КПК продолжают расширяться в непосредственной близости и, как правило, в взаимодополняющих условиях. Корректировка концентраций Activin A и BMP4 изменит процентные показатели КПк против ФГФ против SHF(рисунок 3). Спецификация КТК in vitro в первую...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В нашем протоколе мы описываем методологию генерации сердечных сфероидов и изолированных сердечных полевых КПК. Они могут быть использованы для изучения механизмов спецификации КТК и их свойств, а также для моделирования сердечных камер ных заболеваний. Одна из ранее опубликованных работ использовала линию mESC с двумя флуоресцентными репортерами (Mef2c/Nkx2.5) для изучения кардиогенеза in vitro, однако, оба эти маркера выражаются в эмбриональный день 9,5-10, когда кардиомиоциты уже сформированы26...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего для раскрытия.

Благодарности

E. T. была поддержана Магией, которая имеет значение и AHA. К. К. получил поддержку грантов от NICHD/NIH (R01HD086026), AHA и MSCRF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
β-меркаптоэтанолSigmaM6250
0,1% (w/v) ЖелатинEMD MilliporeES-006-B
100 мМ Пируват натрияGibco11360
100x Pen/StrepGibco15070-063
1x PBS без кальция и магнияThermo Fisher Scientific21-040-CV
20% ПараформальдегидThermo Fisher Scientific50-980-493
мл полистирольная круглодонная трубка с 40&мкм; m клеточный фильтрBD Falcon35223
Activin AR & D Systems338-AC-010
Аскорбиновая кислотаSigmaA-4544
B27 минус витамин А (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
BMP4R & D Systems314-BP
Бычья сыворотка АльбуминSigmaA2153
Сортировщик клетокSonySH800Sony или любой другой флуоресцентно-активируемый сортировщик клеток
Сетчатый фильтр для клеток 70μ mThermo Fisher Scientific08-771-2
Центрифуга Sorvall Legend XTThermo Fisher Scientific75004508
CHIR99021Selleck chemicalsS2924
CO2 ИнкубаторThermo Fisher Scientific51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 колбаCorning07-200-875
Бесчисленные II FL автоматизированный счетчик клетокThermo Fisher Scientific
Donkey против мышей IgG вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA-31571, Лот #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)Gibco11965-092
EDTASigmaE6758
ESGRO (LIF)Микроскоп MilliporeESG1106
EVOS FLThermo Fisher ScientificAMF4300
сыворотка плода крупного рогатого скотаInvitrogenSH30071.03
Glasgow' s MEM (GMEM)Gibco11710035
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
Ветчина s F12Gibco10-080-CV
HEPESSigmaH3375
IMDMGibco12440053
Monothioglycero (MTG)SigmaM-6145
Мышиное антитело к тропонину TThermo Fisher ScientificMS-295-P1
N2-SUPPLEMENTGibco17502-048
Второстепенное раствор аминокислоты (NEAAInvitrogen11140-050
PD0325901SelleckchemS1036
PerCP-efluor 710 конъюгированное антитело против Cxcr4Thermo Fisher Scientific46-9991-82
Чашка для суспензии 150 мм x 25 ммCorning430597
T25 колбыCorning353109
TrypLE (Trypsin)Gibco12604
Y-27632 (ингибитор ROCK)Технологии стволовых клеток72304
5

Ссылки

  1. Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  2. Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  3. Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  6. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  7. Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
  8. Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
  9. Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292(2013).
  10. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
  11. Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
  12. Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
  13. Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
  14. Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
  15. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  16. Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
  17. Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
  18. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
  19. Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
  20. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  21. Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413(2012).
  22. Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
  23. Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164(2014).
  24. Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
  25. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140(2018).
  26. Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Прогенторные клетки сердечного поляэмбриональные стволовые клеткифлуоресцентный репортерный анализанализ методом проточной цитометриипротокол изоляции клетокформирование сердечных сфероидовсортировка клеток методом FACSповерхностный маркер Cxcr4репортер Hcn4-GFP
В vitro Поколение мыши сердце поле конкретных сердечных клеток-прародителей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.