Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Краткосрочные свободно плавающие культуры фрагмента от взрослого человеческого мозга

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59845

⸱

5 ноября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол по подготовке свободно плавающих срезовых культур из мозга взрослого человека. Протокол представляет собой вариацию широко используемого метода культуры срезов с использованием мембранных вставок. Это простой, экономически эффективный, и рекомендуется для запуска краткосрочных анализов, направленных на разгадать механизмы нейродегенерации за возрастных заболеваний мозга.

Аннотация

Organotypic, или срез культур, были широко использованы для моделирования аспектов центральной нервной системы функционирования в пробирке. Несмотря на потенциал среза культур в неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно из человеческих субъектов. Использование взрослых человеческих тканей для подготовки среза культур особенно привлекательна для углубления понимания человеческих нейропатологий, так как они имеют уникальные свойства, характерные для зрелого человеческого мозга, не хватает ломтиков, произведенных у грызунов (обычно неонатальных) нервной ткани. Этот протокол описывает, как использовать ткани мозга, собранные из живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге, чтобы подготовить краткосрочные, свободно плавающие культуры среза. Также представлены процедуры поддержания и проведения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур. Репрезентативные результаты показывают, что типичная ламинирование корковой линии человека сохраняется в ломтиках после 4 дней in vitro (DIV4), при ожидаемом присутствии основных типов нейронных клеток. Кроме того, ломтики на DIV4 проходят надежную гибель клеток, когда оспаривается с токсичным стимулом (H2O2), что свидетельствует о потенциале этой модели, чтобы служить в качестве платформы в анализсмерти смерти клеток. Этот метод, более простой и экономически эффективной альтернативой широко используемому протоколу с использованием мембранных вставок, в основном рекомендуется для проведения краткосрочных анализов, направленных на распутывание механизмов нейродегенерации за возрастными заболеваниями мозга. Наконец, хотя протокол посвящен использованию корковых тканей, собранных у пациентов, представленных на хирургическое лечение фармакорезистентной височной эпилепсии, утверждается, что ткани, собранные из других областей мозга / условий также должны быть рассматривается в качестве источников для производства аналогичных свободно плавающих срезовых культур.

Введение

Использование человеческих образцов в исследованиях однозначно отличный вариант для изучения патологий человеческого мозга, и современные методы открыли новые пути для надежных и этических экспериментов с использованием пациента полученных тканей. Такие методы, как organotypic / срез культур, подготовленных из взрослого человеческого мозга все чаще используются в парадигмы, такие как оптогенетика1, электрофизиология2,3,4,5, пластичность 6,7,8,9, нейротоксичность / нейропротекционистство10,11,12,13,клеточная терапия14, скрининг нанаркотики 15,16,17, генетика и редактирование генов12,18,19,20, среди других, как стратегия для лучшего понимание неврологических заболеваний во взрослом возрасте.

Понимание механизмов, лежащих в основе патологий человеческого мозга, зависит от экспериментальных стратегий, которые требуют большого количества испытуемых. И наоборот, в случае срезаных культур, хотя доступ к пробам человека по-прежнему затруднен, возможность генерации до 50 ломтиков из одного коркового образца частично обходит необходимость найма нескольких добровольцев за счет увеличения количество репликатов и выполненных анализов на собранную ткань21.

Несколько протоколов для мозга organotypic / срез культур были описаны, начиная от классических проектов oculo22,23 роликовой трубки24,25,26, полупроницаемые мембраны интерфейс27,28,29,30, и свободно плавающие ломтики31,32. В зависимости от особенностей экспериментального дизайна, каждая техника имеет свои преимущества и недостатки. Краткосрочные, свободно плавающие культуры ломтиков из мозга взрослого человека в некоторых случаях выгодно по сравнению с методом, используемым Stoppini и др.27, если учесть тот факт, что, хотя долгосрочные выживания клеток в пробирке, как правило, является серьезной проблемой при оценке культурный метод, во многих экспериментах только короткие периоды времени в культуре необходимы12,31,32,33,34,35. В этих условиях использование свободненских культур представляет собой преимущество более простого и экономичного, а также более точного напоминания первоначального состояния тканей человека, чем ломтики, хранящиеся в культуре в течение 2-3 недель.

Несмотря на потенциал среза культур к неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно от человека. В этой статье описывается протокол об использовании собранной ткани мозга от живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге для подготовки свободно плавающих культур среза. Процедуры для поддержания и выполнения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур подробно. Этот протокол оказался ценным для анализа жизнеспособности и нейронной функции в исследованиях механизмов нейропатологии, связанных с взрослой жизнью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Ткани мозга живых взрослых были получены от пациентов, проходящих резецкую нейрохирургию для лечения фармакорезистентной эпилепсии височной доли(рисунок 1А). Все процедуры были одобрены Комитетом по этике из клиники больницы в Рибейран Прето медицинской школы (17578/2015), и пациенты (или их юридическое лицо) согласились и подписали обоснованное согласие условия. Сбор ткани был сделан нейрохирургии команды в Центре хирургии эпилепсии (CIREP - Клиники больницы в Рибейран Прето медицинская школа, Университет Сан-Паулу, Бразилия).

1. Стерилизация материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы и растворы должны быть стерилизованы перед использованием.

  1. Стерилизовать все хирургические инструменты и вибратом нарезки материала (нож держатель, образец диска, буфер лоток) в сухой стерилизации духовки для 4 ч при температуре 180 градусов по Цельсию.
  2. Стерилизовать чувствительный к температуре материал или оборудование с помощью УФ или гамма-облучения.
  3. Стерилизовать средства массовой информации и растворы путем автоматической или фильтрации через 0,22 мкм пор мембраны.

2. Подготовка решений

  1. Подготовка 15-20 мл транспортного раствора: 50% v/v Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) pH 7.4, 50% v/v базальный средний для поддержания послеродовых и взрослых нейронов мозга(Таблица материалов),дополненная 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1- пиперетанеанесульфоновая кислота (гепы), 3 мг/мл глюкозы и 33 мкг/мл гентамицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Транспортное решение должно быть охлаждено и насыщено кислородом (пузырь каббогена) в течение не менее 20 минут до сбора образцов.
  2. Приготовьте 300 мл нарезки (HBSS дополнено 10 мМ HEPES и 3 мг/мл глюкозы) и охладите его в морозильной камере до точки первоначального кристаллического образования.
  3. Подготовка 20 мл культуры среды: базальная среда для поддержания послеродовой и взрослой нейронов мозга (Таблица материалов) дополнен1% L-глютамин производной (Таблица материалов), 2% дополнение для нейронной культуры (Таблица Материалы),1% пенициллина/стрептомицина, и 0,25 мкг/мл амфотерицин B.

3. Настройка нарезки аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол идеально выполняется с помощью коллеги из-за логистики сбора проб в хирургическом кабинете.

  1. В ведре соли добавил льда, пусть нарезки раствор отдыха под карбоген смесь восходящей (95% O2, 5% CO2) по крайней мере 20 минут до использования.
  2. Подготовьте блок из 3% агарозы (примерно 2 см х 2 см х 2 см) и суперприклей его на диск образца вибратом для того, чтобы создать дополнительную механическую поддержку образца ткани во время нарезки (Рисунок 1E).
  3. Установите вибратомдля для нарезки: толщина секции 200 мкм, частота вибрации 100 Гц и скорость нарезки от 0,5 до 1,0 мм/с.
  4. Заблокируйте буферный лоток вибратомна к основанию вибратом и добавьте лед, чтобы держать его в холодильнике до получения нарезки раствора и образца, а также на протяжении всей процедуры нарезки.

4. Коллекция образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, человеческая неокортикальная ткань была собрана в хирургическом кабинете и транспортирована в лабораторию.

ПРЕДУправление: При работе с образцами человека следуйте соответствующим протоколам безопасности, установленным Учреждением.

  1. Настройка транспортного аппарата(рисунок 1C), который состоит из: портативный газовый баллон со смесью карбогена, подключенным к клапану давления/потока, который контролирует выход газа, подключенный к кремниевым трубам, который соединяет выход газа с транспортом судно; транспортное судно, обычно коническая центрифуга 50 мл с перфорированной крышкой для ввода газа, содержащая транспортный раствор; и льда для охлаждения образцов во время транспортировки.
  2. Соберите и транспортировать образец(рисунок 1B) немедленно в лабораторию. Погружайте образец в холодный транспортный раствор (постоянно пузырится карбогенной смесью).

5. Нарезка

  1. Перенесите образец в чашку Петри (100 мм х 20 мм), содержащую нарезку раствора и, с помощью тонких хирургических инструментов, тщательно удалите как можно больше оставшихся олова в образце(рисунок 1D).
  2. Выберите лучшую ориентацию образца для производства ломтиков с особыми характеристиками экспериментального дизайна, и с No 24 скальпель лезвие, обрезать плоскую поверхность, чтобы быть основанием приклеены к образцу диска.
  3. Используя одноразовую пластиковую ложку и нежные кисти, соберите фрагмент из чашки Петри и сухой лишний раствор с помощью фильтровальной бумаги (сухой капиллярностью и не прикасайтесь к фрагменту ткани бумагой).
  4. Используя суперклей, прикрепите ткань к диску образца вибратом, пока он не прочно прилип нет к диску и в контакте с блоком агарозы(рисунок 1E).
  5. Поместите диск образца вибратом (с правильно прикрепленной тканью) в буферный лоток вибратом, наполненный нарезным раствором, который должен бурлять в течение всего процесса.
  6. Заблокируйте держатель ножа на месте с лезвием бритвы твердо закреплены.
  7. Нарезка раствор должен покрывать как образец, так и лезвие, только после этого начинайте нарезку(рисунок 1F).
  8. Нарежьте образец на 200 ломтиков мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя некоторые вибратомы вырезать образцы автоматически, внимательное наблюдение и незначительные корректировки в скорости нарезки во время процесса может помочь производить лучшие ломтики. Откажитесь от первоначальных нерегулярных ломтиков.
  9. Перенесите ломтики из буферного лотка в чашку Петри с нарезкой раствора и обрезать свободные края и избыток белой матер в пропорции около 70% коры / 30% белого вещества.

6. Культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в ламинарной шкафе потока в стерильной среде.

  1. Добавьте 600 зЛ культуры среды на хорошо (в 24 хорошо пластины) и инкубировать, по крайней мере 20 мин при 36 КС и 5% CO2 до покрытия ломтиками.
  2. Плита один ломтик в хорошо с помощью кисти(Рисунок 1G).
  3. Если в тарелке есть неиспользованные колодцы, заполните их 400 л стерильной воды.
  4. Инкубировать тарелку при 36 градусах Цельсия, 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая средняя замена должна быть сделана в период между 8-16 ч после покрытия в зависимости от размера ломтика.
  5. Дополнение 10 мл ранее подготовленной культуры среды с 50 нг/мл мозга, полученных нейротрофический фактор (BDNF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых 8-16 ч, ломтики инкубируются в 600 л среды, чтобы избежать лишения питательных веществ и подкисления, так как среднее потребление в этой фазе ускоряется. На следующем этапе объем средней скважины корректируется до 400 кЛ.
  6. Удалите 333 л условного носителя из каждой скважины и добавьте 133 л свежей bDNF-дополненной среды.
  7. Повторите процесс средней замены каждые 24 ч, заменив одну треть условного носителя на свежую bDNF-дополненную среду.

7. Оценка здоровья, морфологии и функции в культурных ломтиках

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать гибель клеток с целью иллюстрации в репрезентативных результатах, некоторые ломтики были представлены на 24 ч лечения с окислительным индуктором стресса H2O2. Шаги 7.1.2 и 7.1.3 описывают использование H2O2 для индуцирования клеточной смерти.

  1. Жизнеспособность клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Простой, простой метод для оценки нейротоксических / нейрозащиты в оспаривается срез культур 3-(4,5-диметилтилтиазол-2-yl)-2,5-дифенилтетриум (МТТ) анализ36, который измеряет процент метаболических активных клеток в нормальных условиях по сравнению с обработанными образцами.
    1. В ламинарном шкафу потока замените одну треть среды на свежую среду.
    2. Из 30% H2O2 бульонного раствора добавьте объем H2O2 в скважину, чтобы достичь предполагаемой конечной концентрации (30 мМ или 300 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: H2O2 был добавлен после ежедневного изменения среды, чтобы гарантировать надлежащее снабжение свежими питательными веществами до вызова.
    3. Инкубировать тарелку на 24 ч при 36 градусах Цельсия, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После H2O2 лечения (или других токсичных стимулов интереса), следующие шаги описывают определение жизнеспособности клеток ПО MTT.
    4. Добавьте 40 зл раствора МТТ к конечной концентрации 0,5 мг/мл к каждой скважине в пластине.
    5. Инкубировать тарелку при 36 градусах Цельсия, 5% CO2 на 3 ч.
    6. Вымойте ломтики фосфат-буферированным сольником (PBS) и перенесите на микротрубку.
    7. Тщательно удалите любой оставшийся раствор путем пипетки.
    8. Взвесьте микротрубки, содержащие ломтики, чтобы определить массу каждого ломтика (это ключ к нормализации полученных показаний абсорбции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости образцы могут быть заморожены (-20 градусов по Цельсию) на данном этапе для последующей обработки.
    9. Гомогенизировать ломтики в 200 л изопропанола/HCl с помощью моторизованного пестика.
    10. Центрифуга при комнатной температуре (RT) в течение 2 мин при 2600 х г.
    11. Соберите супернатант и измерьте абсорбцию на уровне 540 нм.
  2. KCl-индуцированной нейронной деполяризации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфорилирование митогена активированного белка киназы (MAPK) сигнализации каскадного белка ERK, а затем западного blotting, может быть использован для количественной оценки нейрональной реакции на KCl-индуцированной деполяризации37 .
    1. На шкафу потока замените культурную среду на 300 qL HBSS, ранее уравновешиваемый до 36 градусов по Цельсию.
    2. Замените HBSS 300 л свежих HBSS, ранее уравновешиваемых до 36 градусов по Цельсию.
    3. Инкубировать тарелку при 36 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 15 мин.
    4. Замените HBSS либо свежим HBSS, либо деполяризационным раствором 80 мМ KCl (как при 36 градусах Цельсия), так и инкубировать при 36 градусах Цельсия, 5% CO2 на 15 мин.
    5. Перенесите ломтики из тарелки в микротрубки. На этом этапе, ломтики могут храниться при -20 градусов по Цельсию для последующей обработки.
    6. Подготовка тканей экстракты в 150 л радиоиммунопреционных анализ (RIPA) буфер (50 мм Tris-HCl; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1% неионический сурфактант; 0,1% натрия dodecyl сульфат; рН 7,5). Экстракты centrifuge при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин при 16000 х г,собирают супернатант и определяют общую концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда.
    7. Нагрузка 30 мкг общего белка на 12% натрия dodecyl сульфат полиакриламид гель электрофорес (SDS-PAGE).
    8. После электрофореза перенесите содержание геля на мембрану нитроцеллюлозы.
    9. После блокирования мембраны с 5% обезжиренного сухого молока в TBS плюс 0,1% Tween, инкубировать с мышью анти-pERK (1:1,000) для 16 ч при 4 C. После мытья, инкубировать в течение 2 ч на RT с кроликом анти-ERK1/2 (1:1,000).
    10. Инкубировать с соответствующими HRP-конъюгированных вторичных антител на RT в течение 1 ч.
    11. Показать с предпочтительным субстратом HRP.
  3. Морфологическая оценка
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к выживанию клеток и функциональным оценкам, важно проанализировать морфологию тканей. Имейте в виду, что резекция культивированный кусок является важным шагом к производству как можно больше высококачественного материала, насколько это возможно для морфологического анализа.
    1. Фиксация, криозащита и резекция ломтиков
      1. Перенесите ломтики из колодцев со средой культуры в новую 24 хорошо пластины, содержащие PBS.
      2. Удалить PBS и добавить 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Важно, чтобы срезы оставались плоскими до добавления PFA. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
      3. Тщательно удалите раствор PFA и добавьте 1 мл 30% сахарозного раствора. Инкубировать 48 ч при 4 градусах Цельсия.
      4. Установите замораживание микротома до -40 градусов по Цельсию.
      5. Подготовьте основание сахарозы на стадии микротома, где следует разместить ломтики(рисунок 2А). Пусть он полностью заморозить и осторожно вырезать некоторые из замороженных сахарозы для получения плоской поверхности, на которой ломтик будет размещен.
      6. Поместите каждый ломтик на растянутую пластиковую пленку и используйте кисть, чтобы плоские ткани.
      7. Перенесите растянутый срез на замороженную основу сахарозы одним ходом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это не возможно переместить ломтик, как только он находится над замороженным основанием сахарозы. Выполняйте этот шаг передачи тщательно.
      8. Пусть ломтик отдохнуть в течение 5-10 минут для правильного замораживания.
      9. Нарежьте нарезку на 30 мкм секций.
      10. Перенесите 30 мкм секций в чашку Петри, содержащую PBS.
      11. Переход к гистологии протокола более адекватной экспериментальной конструкции.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 30 мкм разделы могут быть легко использованы для свободно плавающей иммуногистохимии, установлен на микроскопии слайды для дальнейшей гистологии или хранится в антифризе растворпри в -20 градусов по Цельсию.
    2. Иммуногистохимия
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция стандартные протоколы различаются между лабораториями. Для подробной версии протокола, используемого здесь, обратитесь к Horta et al.38. Первичные антитела, используемые для иммуносохранения, представленные на рисунке 2, включают нейронные ядра (NeuN), здоровый зрелый нейронный маркер, глиальный фибрилловый кислотный белок (GFAP), маркер асторцитов, ионизированный адаптер кальция (Iba-1) и микроглии Маркер.
      1. Инкубировать ломтики в блокирующем растворе (например, 2% нормальной ослиной сыворотки в PBS) в течение 40 мин.
      2. Инкубировать на ночь с первичными антителами под мягким возбуждением при 4 градусах Цельсия.
      3. После мытья pbS, инкубировать в течение 120 мин с биотинилатированных вторичных антител под мягким возбуждением на RT.
      4. После мытья с PBS, инкубировать на RT в течение 120 мин с avidin-peroxidase колдъюг (Таблица материалов).
      5. Выявить с DAB 0,04% никеля аммония.
      6. Смонтируйте окрашенные секции на слайдах с микроскопией с покрытием с желатином и дайте им высохнуть. Обезвоживание в этаноле, диафанизировать в ксилене, закончить с монтажом среды (Таблица материалов), крышка с крышкой, и изображение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Критическим аспектом для оценки качества и здоровья культивированных ломтиков является наличие и типичная морфология ожидаемых типов нервных клеток, нейронов и глиальных клеток. Типичная архитектура ламинирования корковой ламинирования человека наблюдалась в ломтике на DIV4, выявленном нейрональной иммуномаркировкой(рисунок 2D). Кроме того, наблюдалось ожидаемое присутствие микроглии и астроглии(рисунок 2B,C). Эти результаты пок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол для производства свободно плавающих, краткосрочных срезовых культур является альтернативным методом для культивирования взрослых человеческих неокортикальных ломтиков. Такой протокол для срезовых культур может быть поддается исследованиям по (но не ограничен) оптогенетике1,44,45,электрофизиологии2,3,4,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается ФАПЕСП (Грант 25681-3/2017 as), CAPES (Пост-докторская стипендия PNPD/INCT-HSM для А.Ф. и додокторской стипендий н.д.М.) и FAEPA. G.M.A. имеет стипендию магистра от FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. имеет научно-исследовательскую стипендию CNPq. Мы благодарим пациентов и их семьи за пожертвование резецированных тканей для этого исследования. Мы хотели бы отметить поддержку жителей, медсестер, техников и команды CIREP из клинической больницы в Медицинской школе Рибейран Прето, Университет Сан-Паулу, которые помогали на различных этапах этого процесса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-ПропанолMerck1096341000
Акриламид/Бис-Акриламид, 30% растворSigma AldrichA3449 
АгарозаSigma AldrichA9539
Персульфат аммонияSigmaA3678-25G
Амфотерицин BGibco15290-018
Антитела против ERK 2 (кролик)Santa Cruz Biotecnologysc-154Разведение 1:1,000 в BSA 2,5%
Антитела против pERK (мышь)Santa Cruz Biotecnologysc-7383Разведение 1:1,000 в BSA 2,5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
бычья сыворотка альбуминSigma AldrichA7906
Bradford 1x краситель реагентBioRad500-0205
EDTASigmaT3924используется в буфере RIPA
глюкозаMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
Сбалансированные соли ХэнкаSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
Соляная кислотаMerck1003171000
перекисью водорода (H2O2)Vetec194
Мышь IgG, HRP-связанный целый Ab (анти-мышь)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000используется в буфере RIPA
Neurobasal AGibco10888-022
Обезжиренное сухое молоко (Molico)NestléИспользуется для блокировки мембран
PBS Buffer pH 7,2Laborclin590338
Penicilin/StreptomicinSigma AldrichP4333
Хлорид калияMerck1049361000
Prime Western Blotting Detection ReagentGERPN2232
кролика IgG, HRP-связанный целый Ab (против кролика)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750используется в буфере
RIPA TEMEDGE17-1312-01
Тиазолил синий Тетразолия бромид (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378Используется в буфере RIPA
Triton X-100SigmaX100Используется в буфере RIPA
Ultrapure ВодаMilliporeСтерильная вода, полученная из системы очистки воды MiliQ
Equipment and Material
24-луночные планшетыCorningCL S3526Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (нитроцеллюлозная мембрана) GE29047575
Карбогеновая смесьWhite Martins95% O2, 5% CO2
CO2 инкубаторNew Brunswick ScientificCO-24Инкубация ломтиков 5% CO2, 36º C
Считыватель микропланшетовМолекулярные устройства Микротрубки
Greiner0016081,5 мл Микротрубка
Моторизованный пестикKimble Chase
Пластиковая ложкаРазмер десертной ложки
Бритвенное лезвиеBicChrome Platinum, используется в нарезке с вибратомом
ЛезвиескальпеляБектон Дикинсона (BD)Номер 24Используется для среза ткани; рекомендуется суперклей того же размера или меньшего
(Loctite Super Bonder)HenkelСостав: Этилчианоакрилато; 2-пропеновая кислота; 6,6'-ди-терк-бутил-2,2'-метиленоди--крезол; гомополимер
Вибратом;Leica14047235612 - VT1000S
Наименование материала/оборудования для иммуногистохимии
антитела anti-NeuN (мышь)Millipore MAB377Разведение 1:1,000 в Фосфатном буферном
антителе анти-GFAP (мышь)MerckMAB360Разведение 1:1,000 в Фосфатном буферном
антителе анти-Iba1 (кролик)AbcamEPR16588 - ab178846Разведение 1:2,000 в Фосфатном буфере
Биотинилированное антимышиное антитело IgG (H+L)ВекторBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
ЭнтелланMerck107960
ЭтанолMerck1.00983.1000
Желатиновыйсинтезатор00G1002.02.AEиспользуется для покрытия слайдов
MicrotomeLeicaSM2010Rоснащен морозильным столиком (BFS-10MP, Physiotemp), установлен на -40º C
Нормальная ослиная сывороткаJackson Immuno Research017-000-121
ПараформальдегидСигма Олдрич158127
кролика IgG, HRP-связанный целый Ab (против кролика)GENA934-1ML
Слайды (Star Frost)Knittel Glaserс желатиновым покрытием слайды
SucroseVetec60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Пероксидаза, Стандарт)VectorPK-4000, Набор Стандартный
КсилолСинт01X1001.01.BJ
размера

Ссылки

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20(2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103(2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002(2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Слоистость корыбиохимические анализыметоды клеточной биологиииммуногистохимиясекционирование на вибратомевоздействие перекиси водородаМТТ-тестфосфорилирование ERK
Краткосрочные свободно плавающие культуры фрагмента от взрослого человеческого мозга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.