הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד

5.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59918

⸱

8 ביולי 2019

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Houston, 2Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

במאמר זה

סיכום

שיטת ה-DNA כפול מפותחת כדי לקבוע את מיקום mRNA במהלך הריבוטרנסלוקציה, אשר נשענת על כוחות הדיסוציאציה של דופלקסים DNA-mRNA הנוצר. עם יחיד-נוקלאוטיד החלטה ויכולת להגיע שני הקצוות של mRNA, זה יכול לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוכמה ולחקור אחרים חומצות גרעין displacements.

תקציר

הריבוכמה הטרנסלוקציה מתייחסת לתנועה הריבוזומלית ב-mRNA על-ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt), שהוא השלב המרכזי בסינתזה של חלבונים. כדי לחקור את מנגנון המנגנון, קיימות שתי דרישות טכניות חיוניות. ראשית, רזולוציה בודדת של nt שיכולה לפתור טרנסלוקציה רגילה מ-frameshifting, שבמהלכה הריבוכמה נע על-ידי אחר מ-3 nt. השני הוא היכולת לחקור הן את צדי הכניסה והיציאה של mRNA כדי להבהיר את התמונה כולה של טרנסלוקציה. אנו מדווחים על שיטת ה-DNA הכפולה המבוססת על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים של הדופלקסים של DNA-mRNA, המתקבל על ידי שריד מגנטיזציה מגנטית שארית (חברות).  עם 2-4 ברזולוציה הכוח pN, הבחינה הסרגל כפול הוא מספיק כדי להבדיל בין שלבי הטרנסלוקציה שונים. על ידי יישום מקשר ארוך על DNAs בדיקה, הם יכולים להגיע mRNA בצד הנגדי של ריבוכמה, כך מיקום mRNA יכול להיקבע עבור שני הצדדים. לכן, השיטת הסרגל הכפולה מתאימה באופן ייחודי לחקירת הטרנסלוקציה הריבומוגית, ולתנועת חומצת גרעין באופן כללי. אנו מראים תוצאות הנציג אשר הצביעו על mRNA בלולאה היווצרות ונפתר טרנסלוקציה נורמלית מ frameshifting.

מבוא

עקירה ביוקולולקולרית היא פרמטר בסיסי בלימוד המנגנון של הפונקציות הביולוגיות הקשורות. דוגמה אחת היא הריבוכמה טרנסלוקציה1,2, שבמהלכה הריבוכמה נע על ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt) על שליח RNA (mrna) בדרך כלל, ועל ידי אחד, שניים, או מספר אחר של nt מלבד שלושה במקרה של frameshifting. לפיכך, נדרשת רזולוציה יחידה של מערכת שליטה בסרגל מולקולרי כדי להבדיל בין גודלי השלבים השונים. אתגר גדול יותר הוא לחקור את התנועה הריבוחלק הן על הכניסה והן בצד היציאה. במילים אחרות, רק עם מערכת סרגל כפול נוכל לגלות אם mrna הוא משורשר בצורה חלקה דרך ריבוכמה, או יש שלבי ביניים שבו שני הצדדים יש גדלים צעד שונה המוביל לתוך מקוטע או בלולאה ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת הריבוכמה מתחמי

  1. להפוך 1,000 mL של TAM10 מאגר, אשר מורכב 20 מ"מ-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ Mg (OAc)2, 30 מ"מ NH4Cl, 70 mm KCL, 5 מ"מ EDTA, 7 מ"מ bme (2-mercaptoethanol), ו 0.05% Tween20.
  2. הכינו את חמשת התערובות שמופיעות בטבלה 1.
    הערה: הריבוחלק היה מהזן MRE60011. EF-Tu: גורם התארכות בלתי יציב. EF-Ts: גורם התארכות באורווה. GTP: guanosine triphosphate. פפ: פוספאו (enol) פירובט.
  3. מודטה את חמשת מתערבב בנפרד ב 37 ° c עבור 25 דקות לפני ביצוע הריבוכמה תסביכים. הכן את חמשת הריבוכמה מתחמי לפי שולחן 2.
    הערה: לאחר הטרנסלוקציה; מראש: טרום טרנסלוקציה.
  4. הוסף כל ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג את ערכת האיתור והתצלומים של הרכיבים המרכזיים. זיהוי מגנטי מושגת על ידי מגנטומטר אטומי באמצעות ערכת הסריקה (איור 1א)13. המדגם ממוקם על מוט רכוב על מנוע ליניארי. המנוע מסיע את הדגימה לחיישן האטומי בתוך מגן מגנטי, ואז בחזרה לאתר המקורי לפריקה. מגנטומטר אטומי מזהה את האות המגנטי במהלך סריקת לדוגמה והפיק מעקב איתות, עם האות המקסימלי כאשר המדגם הוא הקרוב ביותר לחיישן. איור 1 B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בתוך השליטה הכפולה שלנו, החרוזים המגנטיים לשחק שני תפקידים חיוניים. ראשית, הם משמשים ככוח התמרה כי הכוח הצנטריפוגלי הוא יחסי למסה הפרוע שלהם. שנית, החרוזים הם נושאות איתותים שזוהו על ידי מגנטומטר אטומי, שכרגע הוא החיישן המגנטי המדויק ביותר. שילוב מניפולציה מכנית וזיהוי מגנטי, שיטת המשרדים מסוגלת לפתור מספר רב של אינטראקציות מולקולריות המבוססות על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים שלהם, שהוא הבסיס של שליטי ה-DNA. השיטת הסרגל כפול מתאימה באופן ייחודי לחקור את שני הצדדים של mRNA במהלך הטרנסלוקציה. מכיוון שזוהי גישה פיזית הנשענת רק.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא דווח על ניגוד אינטרסים פוטנציאלי על-ידי סופרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (R01GM111452, י, S.X.). י. ו. מאשר תמיכה מקרן וולש (E-1721).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רצועת סטירןעיר התעשייהMS-861
זכוכית שקופיותציפויים מאודים60.0 & פעמים; 4.0 & פעמים; 0.3 מ"מ3< / sup>
חומצה אצטיתMillipore SigmaA6283-500ML
3-AminopropyltriethoxysilaneUCT התמחויות 21400088
mPEG-SVALaysan Bio154-82
ביוטין-PEG-SVALaysan Bio152-84
נתרן ביקרבונטMillipore SigmaS5761-500G
דבק אפוקסיDevcon31345
StreptavidinThermoFisher434301
חומצה פוסידיתMillipore SigmaF0756-1G
Neomycin SulfateMillipore Sigma
ויומיצין סולפטMillipore Sigma1715000
Hygromycininvitrogen10687-010
Tris-HClMillipore SigmaT5941-100G
מגנזיום אצטטMillipore SigmaM5661-50G
אמוניום כלורידMillipore SigmaA9434-500G
אשלגן כלורידMillipore SigmaP9333-500G
EDTAGIBCO774750
2-מרקפטואתנולMillipore SigmaM6250-500ML
Tween20Millipore SigmaP1379-250ML
GTPMillipore SigmaG8877-100MG
PEPMillipore SigmaP7127-100MG
פירובט קינאזMillipore SigmaP1506-5KU
סוכרוז Millipore SigmaS7903-5KG
Dynabeads M-280 StreptavidinThermoFisher11205D
mRNAOligo Integrated DNA Technologies1338997275&PRIME;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UAA AAA UAA AAA UGA AAA AUG UUU AAU AAU UUU AAU UUU GG CGC AAU CUG AAC UC-3&PRIME;  
DNA Oligoטכנולוגיות DNA משולבות1574686303?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1648453703?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5'  
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1574686283?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG / TEGBio / -5'  
DNAOligo Integrated DNA Technologies1634727053?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5'  
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781303?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG / TEGBio / -5 '
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781313?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'  
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781323?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG / TEGBio / -5? 
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781333?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG / TEGBio / -5'  
צנטריפוגהEppendorf5427R
מיקרו אולטרה-צנטריפוגהמערבל מערבולת היטאצ'יCS150FNX
VWRVM-3000
מגבר נעילהסטנפורד מערכות מחקרSR530
מגבר נעילהסטנפורד מערכות מחקרSR830
לייזרניופורטTLB-6918-D
מחולל פונקציותסטנפורד מערכות מחקרDS345
גלאי צילוםThorlabsDET36A
1458009

מקורות

  1. Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).
  2. Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בדיקת סרגל DNAספקטרוסקופיה של מגנטיזציה שאריתית מושרית בכוחדיסוציאציית דופלקס mRNAקיבוע קומפלקס ריבוסומליהשפעות של אנטיביוטיקה על טרנסלוקציהזיהוי הסטת מסגרת קריאהדחיקת חומצות גרעיניותמערך מגנטומטר אטומי
שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.