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方法文章

双DNA标尺法以单核苷酸分辨率研究核糖体易位机制

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DOI：

10.3791/59918

⸱

2019年7月8日

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Houston, 2Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

本文内容

摘要

双DNA标尺检测法被开发用于确定核糖体易位过程中mRNA的位置，该方法依赖于形成的DNA-mRNA双链解离所需的解离力。该技术具有单核苷酸分辨率，并能够到达mRNA的两端，可为核糖体易位机制提供深入见解，并可用于探测其他核酸的位移过程。

摘要

核糖体移位是指核糖体在mRNA上精确移动三个核苷酸（nt）的过程，这是蛋白质合成中的核心步骤。为了研究其机制，需要满足两项关键技术要求：第一是单核苷酸分辨率，能够区分正常的移位与移码现象，后者指核糖体移动的距离不是3个核苷酸；第二是能够同时探测mRNA的进入端和出口端，以阐明移位的完整过程。我们报道了一种基于DNA-mRNA双链解离临界力的双DNA标尺检测方法，该力值通过力诱导剩磁谱技术（FIRMS）获得。  双标尺检测方法具有2–4 pN的力分辨率，足以区分不同的移位步骤。通过在探针DNA上引入长连接臂，使其能够到达核糖体另一侧的mRNA，从而可同时确定mRNA在两侧的位置。因此，双标尺检测方法特别适用于研究核糖体移位，以及核酸运动的一般规律。我们展示了代表性结果，这些结果揭示了mRNA呈环状构象，并成功区分了正常移位与移码事件。

引言

生物分子位移是研究相关生物学功能机制的基本参数。一个典型例子是核糖体易位1,2，在此过程中，核糖体通常在信使RNA（mRNA）上精确移动三个核苷酸（nt），而在发生移码的情况下，则可能移动一个、两个或除三个以外的其他数量的核苷酸。因此，需要一种具有单核苷酸分辨率的分子标尺系统，以区分不同的步长。更大的挑战在于同时探测核糖体在进入端和退出端的移动情况。换句话说，只有通过双标尺系统，我们才能揭示mRNA是否平滑地穿过核糖体，或者是否存在中间步骤，即两端具有不同步长，从而导致核糖体内部形成弯曲或成环的mRNA构象。

已开发出多种方法来解决核糖体出口侧（mRNA 的 3' 端）不同步骤的解析难题。双荧光素酶检测法通过测量不同读码框产生的蛋白质比例来区分读码框3,4。但该方法仅适用于 mRNA 的 3' 端，因此不足以提供转位过程的完整图景。质谱法可分析由相应密码子重排所产生的不同肽段片段5，但无法精确定位核糖体在 mRNA 上移动的核苷酸（nt）数目。足迹分析法（toe-printing assay）是另一种常用方法，该方法利用结合在 mRNA 3' 远端的逆转录酶引物，从该位置向核糖体方向进行逆转录6。然而，该方法不适用于正在进入核糖体的 mRNA 5' 端。其他技术，包括单分子方法和荧光方法7，难以实现单核苷酸分辨率。

我们开发了双DNA标尺检测法，该方法能够唯一确定核糖体-mRNA复合物中未被覆盖mRNA的进入和退出位置。 这些标尺DNA是DNA寡核苷酸，无论与mRNA的哪一端结合，均可与核糖体未覆盖的mRNA区域形成特定碱基对（bp）数目的双链结构。这些碱基对数目可精确揭示核糖体在mRNA上移位过程中的位置。双链的碱基对数目通过力致残余磁化谱（FIRMS）测得的关键解离力来确定8。在2–3 pN的力测量不确定度下，关键解离力足以实现单核苷酸（nt）分辨率。通过在DNA标尺上引入连接分子，可探测核糖体在空间位阻一侧的mRNA区域，从而准确分辨不同的核糖体位移。我们已成功揭示了抗生素在移位过程中捕获的mRNA独特环状构象9，并解析了在滑移mRNA序列上共存的不同阅读框10。本文详细描述了双标尺检测法的各个步骤，包括核糖体复合物的制备、玻片表面的功能化修饰、核糖体复合物的固定及其与磁性标记DNA标尺分子的杂交、磁信号检测，以及通过FIRMS进行的力谱分析。 

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方案

1. 核糖体复合物的制备

  1. 配制1,000 mL TAM10缓冲液，其组分为20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM Mg(OAc)2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、5 mM EDTA、7 mM BME（2-巯基乙醇）和0.05% Tween20。
  2. 按照表1列出的成分分别配制五种混合物。
    注：核糖体来源于MRE600菌株11。EF-Tu：热不稳定延伸因子。EF-Ts：热稳定延伸因子。GTP：三磷酸鸟苷。PEP：磷酸烯醇式丙酮酸。
  3. 在制备核糖体复合物前，将上述五种混合物分别于37 °C孵育25分钟。按照表2制备五种核糖体复合物。
    注：Post：转位后；Pre：转位前。
  4. 将每种核糖体复合物分别以1:1的体积比加至1.1 M蔗糖垫上，使用超速离心机在450,000 × g 条件下离心2小时进行纯化。离心后用移液器弃去上清液，用TAM10缓冲液重悬沉淀，随后将核糖体复合物在-80 °C保存。

2. 生物素包被玻片的制备

  1. 玻璃片的初步清洗
    1. 将12片尺寸为60.0 × 4.0 × 0.3 mm3（长 × 宽 × 厚）的玻璃片放入一个短而宽的玻璃皿中。
    2. 向玻璃皿中加入丙酮并超声处理5分钟，然后用超纯水清洗玻璃片5次，并向皿中加水至体积的¾。
    3. 加入10 M KOH至装满玻璃皿，对玻璃片超声处理20分钟，再用清水清洗5次。
    4. 加入乙醇并超声处理5分钟，倒出乙醇后将玻璃片分别在300 °C下干燥3小时。
  2. 氨基硅烷化包被
    1. 将12片已清洗的玻璃片重新放入盛有甲醇的玻璃皿中。用甲醇超声清洗一个PEG化烧瓶5分钟，然后向其中加入25 mL甲醇、1.25 mL水、0.125 mL HAc和0.25 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（AMEO）。
    2. 立即将玻璃皿中的甲醇替换为所制备的AMEO溶液，在室温下孵育30分钟。
    3. 用清水多次冲洗玻璃片，再用氮气吹干。将干燥的玻璃片放入洁净的玻璃皿中。
  3. PEG化
    1. 配制NaHCO3溶液（8.4 mg/mL）和PEG化缓冲液（37.5 mg PEG、6 mg 生物素化PEG、150 μL NaHCO3溶液），在6,000 rpm下涡旋混合1分钟，充分混匀。
    2. 在每片玻璃片上加25 μL PEG溶液，再将另一片玻璃片覆盖其上，确保两片之间无气泡。  将玻璃片放入一个空的移液枪头盒中，确保盒子水平，并置于暗处抽屉中约3小时。
    3. 用清水冲洗玻璃片并再次干燥。将干燥的玻璃片在室温下真空保存，最长可保存2周。

3. 磁性与力测量前的样品制备

  1. 加工一个尺寸为 4 × 3 × 2 mm3 （长 × 宽 × 深）的塑料样品槽。使用环氧树脂将一段生物素包被的玻璃片（长约 5 mm，从第 2 节制备的 60 mm 玻璃片上截取）粘附在样品槽底部表面。
  2. 向样品槽中加入 20 μL 浓度为 0.25 mg/mL 的链霉亲和素水溶液，在室温下孵育 40 分钟。然后用 TAM10 缓冲液冲洗样品槽两次。
  3. 固定核糖体复合物。
    1. 无抗生素条件：用移液器移除样品槽中的缓冲液，然后向样品槽中加入 20 μL 浓度为 0.1 μM 的核糖体复合物（MF-Pre 或 MF-Post）。核糖体复合物将通过 mRNA 5'端的生物素与表面的链霉亲和素结合。在 37 °C 下孵育 1 小时，然后用 TAM10 缓冲液冲洗一次。
    2. 对于同时使用新霉素和夫西地酸的实验：将 MF-Pre 复合物与新霉素在 37 °C 下孵育 10 分钟；将 EF-G 与夫西地酸在 37 °C 下孵育 20 分钟。各组分浓度如下：0.1 µM 核糖体复合物、2 µM EF-G、4 mM GTP、4 mM PEP、0.02 mg/mL 丙酮酸激酶、0.2 mM 新霉素和 0.25 mM 夫西地酸。
    3. 其他抗生素实验操作类似。各组分浓度如下：0.2 mM 卷曲霉素、0.4 mM 潮霉素 B 和 0.25 mM 夫西地酸。
    4. 对于移码研究，对含有滑动序列 U6A 的 MFNF-Pre 和 MFNF-Post 复合物重复上述步骤。分别使用夫西地酸加新霉素以及单独使用夫西地酸。
  4. 移除样品槽中的缓冲液，然后加入 20 μL 浓度为 1 μM 的生物素化探针 DNA 链，在室温下孵育过夜。用 TAM10 缓冲液对形成的 DNA-mRNA 杂交双链冲洗一次。
  5. 移除样品槽中的缓冲液，然后向样品槽中加入 20 μL 浓度为 0.5 mg/mL 的链霉亲和素包被磁珠，在室温下孵育 2 小时。
  6. 小心将样品槽插入离心机转子中并放入离心机。以 84 × g 离心 5 分钟，去除表面未结合的磁性颗粒。

4. 磁性和力测量

  1. 打开激光器
    1. 使用钥匙打开激光器，然后按下电源按钮。
    2. 将锁相放大器1（LIA1）的灵敏度调节至500 mV，并等待约2小时，使原子磁力计预热并达到稳定状态。
  2. 搭建原子磁力计
    1. 运行仪器控制软件并设置测量参数。每次测量时，部分参数可能会有轻微变化。
      注意：原子磁力计包括一个激光器（如上所述）、一台SR830锁相放大器（记为LIA1）、一台SR530锁相放大器（记为LIA2）、DS345函数发生器（记为FG1）和ATF20B函数发生器（记为FG2）、一个高分辨率电机以及一台计算机。在本实验步骤中，应开启以上所有设备。
    2. 设置电机运动模式为 噪声 和默认位置到 0. 按压 锁定 在前面板上，将LIA1的灵敏度重新调整为200 mV。
    3. 调节激光器的电流和电压，找到合适的共振峰及信噪比水平。按下 扫频 在前面板上。注意幅度/宽度比应大于0.5，相位值应小于5度。若不符合，请重新执行扫描步骤。
    4. 将LIA2的输出端连接至激光器的反馈端，以锁定其频率。该放大器通过测量辅助铯池的光学旋转来维持激光频率处于共振状态12该状态持续至测量结束。
    5. 插入函数发生器 FG2，输入一个方波信号（500 mVpp，100 mHz）作为参考信号。该方波对应 100 pT，用于将放大器的电流输出转换为磁信号。随后拔下函数发生器。
    6. 设置电机运动模式为 双向 默认位置设为260 mm。检查温度控制器状态，确保原子传感器处于适当温度（约37 °C）。
    7. 通过两次测量空样品 holder 的信号来检查整个系统的稳定性。减去两条信号曲线后评估稳定性和噪声水平。在30 ms积分时间下，典型的噪声水平和波动应为±2 pT。
  3. 磁化样品
    1. 将样本轻轻放置于磁化站上，静置2分钟。
      注：磁化站由一块永磁体（约 0.5 T）和一个塑料垫片组成。
    2. 将样品放回样品架中。使用 335.4 × g 离心力去除非特异性结合的磁性颗粒。
  4. 施加力后的磁性测量
    1. 使用镊子将样品装载到电机上。点击 锁定 在前面板上启动程序。同时，使用镊子将另一个样品装入样品座中，并放入离心机内。注意，有涂层的玻璃面应朝向离心机中心。
      注意：采用力致剩磁谱学（FIRMS）技术，该技术利用原子磁力计在对样品中的分子相互作用施加机械力后，测量样品的磁信号。此处的分子相互作用发生在DNA标尺分子与核糖体复合物中的mRNA之间。通过逐步提高离心速度来增加作用力。每次施加力后，电机将样品移至原子传感器位置进行测量，然后移回原位。因此，可获得两个磁场分布曲线，分别对应前向扫描和反向扫描过程。13我们仅使用后者来提取峰高，因其具有更高的信噪比。根据校准方波，将电流（nA）中的峰高转换为磁信号幅值（pT）。
    2. 每次测量持续约 5 分钟。当电机返回至 0 时，点击 保存 在前面板上。使用镊子小心地从电机和离心机中取样。采用对应于335.4 × 的初始速度 g （2000 rpm，即所列离心机的每分钟转数） 材料表).
    3. 交换两个样品，通过将离心速度提高100 rpm或类似的步长来施加更强的力。交替处理以逐步增加作用力；在获得10–12个数据点后，得到完整的力谱。
  5. 完成实验
    1. 当所有计划的实验结束后，按照与开启时相反的顺序关闭设备。
    2. 将样品从样品架上取下，浸入乙醇中清洗，以备后续使用。若磁珠污染样品架，需用丙酮清洁样品架。
  6. 数据分析
    1. 打开 Python 分析脚本并输入所有实验数据。点击 加载 方形 输入方波作为参考信号，然后单击 加载 基线 将残余磁信号作为背景输入。
    2. 将整体磁信号的减少定义为 B0. 校正每个磁信号的降低值 B 到 B0 并以百分比形式表示。绘制百分比（B/B0）与离心力对比以获得FIRMS光谱。
      注意：离心力 F 由磁珠的浮力质量计算得出 m (4.6 × 10−15 千克（kg）、离心速度 w 和离心机半径 r （此处为7.5 cm）通过公式 F = mw2r本研究中典型的力分辨率为2-4 pN，力的测量范围为15-95 pN。

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结果

图1展示了检测原理及主要组件的照片。磁信号检测通过使用扫描方案的原子磁力计实现（图1A）13。样品被放置在安装于直线电机上的杆上。电机将样品送入磁屏蔽室内的原子传感器中，检测完成后将其送回原位以便卸载。在样品扫描过程中，原子磁力计检测磁信号并生成信号轨迹，当样品最接近传感器时，信号达到最大值。图1B展示了整个仪器的照片。图1C和图1D分别展示了用于磁化处理的磁化站以及用于施加离心力的离心机的照片。

双DNA标尺检测的原理如图2所示。核糖体复合物通过mRNA的5'端固定在表面。设计两条DNA标尺以精确探测核糖体的位置，每条分别对应mRNA的一侧。当前的固定方式使得mRNA的3'侧易于被DNA标尺探及，...

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讨论

在我们的双标尺检测中，磁性微珠发挥着两个关键作用。首先，它们作为力的传感器，因为离心力与微珠的浮力质量成正比。其次，微珠作为信号载体，可被原子磁力计检测，后者是目前最灵敏的磁传感器。通过结合机械操控与磁性检测，FIRMS技术能够根据分子相互作用的关键解离力分辨大量分子相互作用，这正是DNA标尺的基础。双标尺检测特别适用于在mRNA移位过程中探测其两侧。由于该方法是一种仅依赖双链结构形成的物理手段，因此不受mRNA序列或其他生物学限制因素的制约，相较于依赖生化反应的其他技术具有明显优势。我们已证明，通过使用较长的连接分子，标尺可到达目标结合位点以确定mRNA的位置。具体而言，对于核糖体，连接分子长度为50个胸腺嘧啶（50 T），对应约17 nm的长度，这一尺寸与核糖体的大小非常接近17。所用抗生素的浓度均为文献中常见的典型值。此外，我们的方法也可用于揭示这些抗生素功能起始的阈值浓度。

双尺分析法有两个关键方面。其一是用于分子固定及后续生物反应的精细功能化表面。每次加样和洗涤步骤都应尽量减少对表面的扰动，以确保固定在表面的分子保持完整。对...

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披露

作者未报告存在潜在的利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（R01GM111452，Y.W.，S.X.）提供资助。Y. W. 感谢威尔奇基金会（E-1721）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
苯乙烯条工业市MS-861
玻璃载片蒸发镀膜公司60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
乙酸默克生命科学A6283-500ML
3-氨基丙基三乙氧基硅烷UCT 特种产品公司21400088
mPEG-SVALaysan Bio154-82
生物素-PEG-SVALaysan Bio152-84
碳酸氢钠默克生命科学S5761-500G
环氧胶Devcon31345
链霉亲和素赛默飞世尔科技434301
夫西地酸默克生命科学F0756-1G
硫酸新霉素默克生命科学1458009
硫酸卷曲霉素默克生命科学1715000
潮霉素英潍捷基10687-010
Tris-HCl默克生命科学T5941-100G
乙酸镁默克生命科学M5661-50G
氯化铵默克生命科学A9434-500G
氯化钾默克生命科学P9333-500G
EDTAGIBCO774750
2-巯基乙醇默克生命科学M6250-500ML
Tween20默克生命科学P1379-250ML
GTP默克生命科学G8877-100MG
PEP默克生命科学P7127-100MG
丙酮酸激酶默克生命科学P1506-5KU
蔗糖 默克生命科学S7903-5KG
Dynabeads M-280 链霉亲和素赛默飞世尔科技11205D
mRNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1338997275′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1574686303?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? 
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1648453703?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1574686283?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1634727053?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1386781303?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1386781313?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1386781323?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? 
DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies1386781333?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
离心机Eppendorf5427R
微型超速离心机日立CS150FNX
涡旋混合器VWRVM-3000
锁相放大器斯坦福研究系统公司SR530
锁相放大器斯坦福研究系统公司SR830
激光器纽波特TLB-6918-D
函数发生器斯坦福研究系统公司DS345
光电探测器ThorlabsDET36A

参考文献

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