Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК

Summary

Этот протокол описывает несколько процедур для подготовки высококачественных образцов замороженных тканей во время некропсии для использования в анализе кометы для оценки повреждения ДНК: 1) рубленая ткань, 2) Царапины эпителиальных клеток из желудочно-кишечного тракта, и 3) кубических тканей образцы, требующие гомогенизации с помощью устройства для измельчения тканей.

Abstract

Анализ кометы набирает популярность как средство оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, особенно после воздействия химических веществ или других экологических стрессоров. Использование анализа кометы в регулятивном тестировании генотоксического потенциала у грызунов было обусловлено принятием в 2014 году директивы Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Комета асссея слайды, как правило, готовятся из свежей ткани во время некропсии; однако, замораживание образцов тканей может избежать логистических проблем, связанных с одновременной подготовкой слайдов из нескольких органов на животное и от многих животных в исследовании. Замораживание также позволяет отгружать образцы из объекта воздействия в другую лабораторию для анализа, а хранение замороженных тканей облегчает отсрочку принятия решения о генерации данных о повреждении ДНК для данного органа. Анализ щелочной кометы полезен для обнаружения двух- и однострочных разрывов ДНК, щелочных лабильных поражений и разрывов нитей, связанных с неполным восстановлением иссечения ДНК. Тем не менее, повреждение ДНК может также в результате механических стрижки или неправильной обработки образцов процедур, смешивая результаты анализа. Воспроизводимость в сборе и обработке образцов тканей во время некропсии может быть трудно контролировать из-за колебания лабораторного персонала с различным уровнем опыта в сборе тканей для проверки кометы. Повышение согласованности путем повышения квалификации или развертывания мобильных подразделений, укомплектованных опытным лабораторным персоналом, сопряжено с большими расходами и не всегда может быть осуществимо. Для оптимизации последовательного поколения высококачественных образцов для анализа анализа анализа комет был оценен метод гомогенизации флэш-замороженных кубов ткани с помощью настраиваемого устройства для рубки тканей. Образцы, подготовленные для анализа кометы этим методом, по сравнению по качеству с образцами свежих и замороженных тканей, подготовленными путем измельчения во время некропсии. Кроме того, низкий базовый ущерб ДНК измерялся в клетках из замороженных кубов ткани после длительного хранения.

Introduction

Анализ кометы все чаще используется в качестве средства оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, подвергающихся воздействию химических веществ или других экологических стрессоров^1. Анализ может обнаружить ДНК двух- и однострочных разрывов, щелочных лабильных поражений, и однострочные перерывы, связанные с неполным ремонтом ДНК. Международный совет по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для использования человека (ICH) руководство для фармацевтического тестирования рекомендует ДНК нити асссе, такие как анализ кометы в качестве второго теста в дополнение к грызунов эритроцита микронуклета анализа д....

Protocol

Ткани были собраны в ходе проведения исследований, проведенных на аккредитованных AAALAC объектах в контрактных лабораториях NTP в соответствии с правилами хорошей лабораторной практики (21 CFR Part 58) и протоколами использования животных, утвержденными Институциональным Животным Комитет по уходу и использованию (IACUC) в каждой лаборатории.

1. Урожай и обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно подготовить дубликаты пробных трубок (например, печень) или перенести примерно половину образца в другую трубку для хранения (например, двенадцатиперстной кишки, желудок), чтобы при необходимости провести повтор....

Results

Исследование 1
Печень была собрана из двух когорт ясам Sprague Dawley крыс вводили кукурузное масло в течение 4 дней, пошатнулся на одну неделю. Слайды были подготовлены из свежеизмельченной ткани, замороженных фаршовых тканей и замороженных кубиковых тканей, обработанных в среднем или минковяющий раствор купца с помощью средства для измельчения тканей. Замороженные ткани, полученные от животных из первой когорты, оценивались после хранения морозильной камеры в течение 3,5 месяцев. Замороженные ткани,.......

Discussion

Как было продемонстрировано ранее^7,12,13, правильно обрабатываются флэш замороженных фарш ткани обеспечивает хорошие результаты в анализе кометы. В самом деле, базовые % хвост днк значения для замороженных фарш крысиной и мышиной печени, подготовленные в нашей лаборатории, как правило, 6%, как это рекомендовано в соответствии с рекомендацией опроведении испытаний⁹ для свежефарктных образцов печени крыс. Х.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Криовиалы	Corning Costar	430488
Стоматологические восковые листы	Электронная микроскопия	Науки 72670
Препарирование (измельчение) Микроножницы	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Сбалансированный солевой раствор Хэнка	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Пробирки с низкой температурой плавления Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1,7 мл)	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2 HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Нейтральный буферизированный формалин	Leica	600
лезвия скальпеля	Miltex	4-110
Поршень шприца (1 мл)	Fisher Scientific или Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Туберкулиновый шприц Becton Dickinson или Monoject
Устройство для измельчения тканей	NorGenoTech (Осло, Норвегия)	Нет	Наблюдается небольшая изменчивость диаметра, которая может повлиять на плотное прилегание поршня.
Пинцет, пластиковый	пассаты Direct	DF8088N	армированный нейлон, нестерильный, тупой наконечник, автоклавируемый; tradewindsdirect.com
весы для лодок	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B